春，黎鐵偉繼全

(遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州121001)

人參皂苷Rh2(GS-Rh2)是從人參中提取的一種天然活性成分。國外研究表明［1］，GS-Rh2的抗腫瘤作用較為廣泛，在腫瘤的預防和治療方面具有較強的活性，具有抑制腫瘤的生長和誘導癌細胞凋亡的作用。目前國內(nèi)研究相對較少。2010年6～11月，為了探討GS-Rh2對腫瘤細胞的可能作用機制，我們以人腦膠質(zhì)瘤細胞株U251為實驗材料，觀察GS-Rh2對U251凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 U251(購于中科院上海細胞庫)，GS-Rh2(購于吉林宏久生物科技有限公司)，DMEM 培養(yǎng)基，胎牛血清，MTT、DMSO、DNA Marker DL2000、Taq DNA聚合酶、流式雙染試劑盒、RTPCR試劑盒(大連寶生物公司產(chǎn)品)，Trizol、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體、Bcl-2鼠單抗(美國GBICO公司)。酶聯(lián)免疫檢測儀、流式細胞儀、多功能電泳儀，PCR儀，Biorad凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 按常規(guī)方法在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)U251，用含10% 胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞檢測。

1.2.2 細胞增殖抑制率測算 采用MTT法。取對數(shù)生長期U251接種于96孔培養(yǎng)板(1×104/孔)，加入配制好的GS-Rh2(加藥組)，使其終濃度分別為5、10、20、40、80 μg/ml(以不加 GS-Rh2 者為對照組)，每孔設4個復孔，用新鮮培養(yǎng)基補充至每孔100 μl，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng) 48 h 后，改用不加胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入MTT液(5 mg/ml)20 μl。檢測波長為570 nm處的吸光值(A值)。細胞抑制率=(1－加藥組A值/對照組A值)×100%。通過細胞增殖抑制曲線求出抑制率(IC)為 IC30、IC50、IC70值時的 GS-Rh2 濃度。

1.2.3 細胞凋亡率檢測 收集 IC30、IC50、IC70的GS-Rh2作用48 h后的U251，采用Annexin V-FITC/PI雙標記檢測，用流式細胞術觀察細胞凋亡情況。

1.2.4 U251 中 Bcl-2、Caspase-3 mRNA 及蛋白檢測①U251中Bcl-2、Caspase-3 mRNA檢測:采用RTPCR技術。分別收集對照組和加藥組(IC50)處理12、24、48、72 h 的細胞，按 Trizol試劑盒說明書分別提取細胞中總RNA，逆轉錄制備 cDNA，產(chǎn)物進行PCR。Bcl-2 引物序列:上游:5＇-AAC TCG AGT GAC AAG CCC GTA G-3 ＇，下 游:5 ＇-GTA CCA CCA GTT GGT TGT CTT TGA-3＇，預期擴增片段長度133 bp;Caspase-3引物序列:上游:5＇-AGA CTG ACT GGA AAG CCG AA-3＇，下游:5＇-CGG GAT CTG TTT CTT TGC AC-3＇，預期擴增片段長度342 bp;β-actin 引物序列:上游:5＇-GGC ATG GGT CAG AAG GAT TCC-3＇;下游 5＇-ATG TCA CGC ACG ATT TCC CGC-3＇，預期擴增片段長度500 bp。反應條件:94℃ 5 min后進入下列循環(huán):94 ℃ 30 s、62 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，共39個循環(huán)，72℃延伸7 min后終產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳，成像拍照，用Gene Tools圖像分析軟件分析。各組細胞中Bcl-2、Caspase-3與β-actin基因條帶灰度比為其mRNA半定量表達水平。②U251中Bcl-2、Caspase-3蛋白檢測:采用Western blot法。將對數(shù)生長期細胞換液加入IC50的GS-Rh2，分別作用 0、12、24、48、72 h，裂解細胞，提取細胞總蛋白，電泳分離。以β-actin為內(nèi)對照。Bcl-2/β-actin、Caspase-3/β-actin分別為 Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)用xˉ±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本配對t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GS-Rh2對U251增殖的影響 對照組細胞無生長抑制;給藥組中給予 5、10、20、40、80 μg/ml的GS-Rh2作用后，U251生長抑制率分別為19.34%、33.09%、46.28%、58.37%、72.91%;兩組比較，P ＜0.05，其細胞生長抑制呈劑量依賴關系(P均 ＜0.05)。根據(jù)細胞增殖抑制曲線求得 IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用濃度分別為 10.6、22.3、70.2 μg/ml。

2.2 兩組細胞凋亡情況 對照組細胞凋亡率為3.85%，IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用 48 h 時 U251凋亡率分別為 20.37%、49.39%、70.82%，兩組比較，P＜0.05。隨藥物濃度的增加，細胞凋亡率升高(P 均 ＜0.05)。

2.3 U251中 Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達變化成功獲得 Bcl-2 mRNA 133 bp、Caspase-3 mRNA 342 bp。兩組細胞中Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達水平見表1。

表1 兩組不同時點細胞中Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達量比較(±s)

表1 兩組不同時點細胞中Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別Bcl-2 mRNA Caspase-3 mRNA對照組0.968 1 ±0.005 1 0.322 9 ±0.001 7給藥組12 h 0.890 7 ±0.004 1 0.401 8 ±0.001 5 24 h 0.763 2 ±0.004 3* 0.744 9 ±0.004 2*48 h 0.431 9 ±0.001 4* 0.884 1 ±0.004 4*72 h 0.357 8 ±0.001 8* 0.976 4 ±0.004 9*

2.4 U251中 Bcl-2、Caspase-3蛋白表達變化 隨GS-Rh2作用時間的延長，U251中Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低、Caspase-3蛋白表達明顯增高。見表2。

表2 兩組不同時點細胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達量比較(±s)

表2 兩組不同時點細胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別 Bcl-2蛋白 Caspase-3蛋白對照組0.82 ±0.02 0.27 ±0.06給藥組12 h 0.72 ±0.02 0.39 ±0.01 24 h 0.62 ±0.02* 0.59 ±0.02*48 h 0.40 ±0.05* 0.69 ±0.02*72 h 0.29 ±0.02* 0.81 ±0.02*

3 討論

目前手術切除是腦膠質(zhì)瘤主要的治療手段，但臨床遠期療效不理想。大量研究表明，GS-Rh2在腫瘤的預防和治療方面具有較強活性，Rh2對多種腫瘤細胞如小鼠黑色素瘤B16細胞、C6膠質(zhì)瘤細胞、人肝癌細胞SK-HEP-1等具有增殖抑制和誘導凋亡作用［2］;Rh2可以從誘導細胞凋亡、誘導細胞分化、抑制腫瘤DNA合成、提高機體免疫功能等各方面發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。GS-Rh2的抗腫瘤作用較為廣泛，既可阻滯細胞周期，誘導癌細胞凋亡和抑制腫瘤的生長或誘導細胞分化使其逆轉，抑制腫瘤的轉移;又可調(diào)節(jié)機體免疫功能，增強機體對疾病的抵抗能力;還可增強抗癌藥的藥效。

細胞凋亡是一極其復雜的生物學過程，是細胞在各種死亡信號刺激后發(fā)生的一系列瀑布式激活的主動性死亡過程，它受多種基因調(diào)控，其中Bcl-2是最為重要的抑制細胞凋亡的基因。Bcl-2高表達的細胞存活時間明顯地延長［4］，其主要通過產(chǎn)生抗氧化劑或抑制氧自由基而抑制細胞凋亡［5］，是細胞凋亡的關鍵性調(diào)節(jié)因子［6］。

細胞凋亡過程還與 Caspase家族密切相關［7，8］。Caspase-3是目前發(fā)現(xiàn)的Caspase家族中引起細胞凋亡的關鍵性酶，也是參與細胞凋亡的主要成分。有研究結果表明［9，10］，通過抑制 Caspase-3 基因活性或拮抗其功能可使細胞凋亡受抑，細胞可無限增殖，因此Caspase-3對于調(diào)控細胞凋亡起重要作用。

本研究結果顯示，GS-Rh2對U251有增殖抑制作用，且隨著GS-Rh2藥物濃度的增加，細胞受抑制程度明顯增強。根據(jù)細胞增殖抑制曲線求得IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用濃度分別為 10.6、22.3、70.2 μg/ml。在 IC50的 GS-Rh2 作用 48 h 后，U251呈明顯的抑制增殖。流式細胞術檢測細胞凋亡率證實，IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用48 h 時 U251 凋亡率分別為 20.37%、49.39%、70.82%，且隨藥物濃度的增加，細胞凋亡率升高(P＜0.05)。證實GSRh2可抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞株U25l的增殖，可以導致細胞凋亡率的增加，表明GS-Rh2在膠質(zhì)瘤治療中將具有一定的療效。

我們通過RT-PCR及Western blot技術檢測發(fā)現(xiàn)，U251經(jīng)IC50的GS-Rh2處理后，自處理后的24 h開始 Bcl-2 mRNA、蛋白表達水平逐漸降低，Caspase-3 mRNA、蛋白表達水平逐漸增高，表明GSRh2誘導U251凋亡作用與下調(diào)細胞中Bcl-2表達、上調(diào)Caspase-3表達有關。

通過研究我們認為，Gs-Rh2是一種天然的抗腫瘤藥物，對于臨床腫瘤的治療可發(fā)揮重要作用。

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