張 弘, 許可銀, 周國雄, 朱郁飛, 魏 群, 李 峰
(1南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,江蘇 南通 226001;2鹽城市城南醫(yī)院消化內(nèi)科,江蘇 鹽城 224001)
重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一種嚴(yán)重的全身性疾病,病情兇險,死亡率高[1],其嚴(yán)重程度及多器官功能障礙與多種細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān),但趨化因子在其中起了何種作用尚不十分清楚。趨化因子是一類能趨化細(xì)胞定向移動的小分子分泌蛋白,其主要作用為趨化和激活白細(xì)胞,參與炎癥反應(yīng),其氨基酸組成具有特異的半胱氨酸,根據(jù)半胱氨酸的排列位置不同可分為 C、CC、CXC和CX3C 4類共50余種。目前認(rèn)為,fractalkine(FKN)是CX3C族中的唯一成員,主要表達(dá)于人體活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面,同時也可以可溶性形式存在,在炎癥局部發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞聚集和維持穩(wěn)態(tài)等作用[2,3]。本實(shí)驗通過建立大鼠重癥急性胰腺炎模型,并采用烏司他丁(ulinastatin,UT)進(jìn)行干預(yù),ELISA法檢測不同時點(diǎn)血清中FKN水平;采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測FKN mRNA在SAP模型的胰腺組織和肺組織中的表達(dá)變化情況,及其與病理組織學(xué)改變的關(guān)系,探討FKN在SAP發(fā)病過程中的作用,為臨床工作中急性胰腺炎治療方案的進(jìn)一步完善提供新的實(shí)驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
1.1 動物 健康雄性SD大鼠72只,清潔級,體重(200±30)g,由南通大學(xué)實(shí)驗動物中心提供,隨機(jī)分成3組:SAP組、烏司他丁治療組(SAP+ulinastatin treatment,SAP+UT)和生理鹽水對照組(control),每組24只。
1.2 主要試劑 淀粉酶測定試劑盒(四川邁克科技有限公司);大鼠FKN ELISA試劑盒(上海西唐生物公司);Total RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司];自行設(shè)計FKN和GAPDH引物,由上海博彩生物科技有限公司合成。
2.1 動物模型 大鼠術(shù)前禁食12 h,禁水6 h,用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉,正中切口進(jìn)腹,膽胰管十二指腸開口處予無損傷金屬夾夾閉,注射器針頭向十二指腸開口方向插入膽胰管,SAP組以0.1 mL/min的速度向膽胰管內(nèi)注射4%?;悄懰徕c,劑量為1 mL/kg,5 min后拔除注射針,松開金屬夾,縫合關(guān)腹;UT在造模成功后立即在大腿皮下注射UT(3×104U/kg)進(jìn)行干預(yù)治療;對照組向膽胰管注射與?;悄懰徕c組等量的無菌生理鹽水。每組再隨機(jī)分成4個亞組,每個亞組6只大鼠。分別于術(shù)后1、3、6、12 h予以處死,心臟取血,置37℃30 min后離心收集血清于4℃保存,用于淀粉酶和ELISA檢測;留取胰腺和肺組織,一份-80℃貯存用于實(shí)時熒光定量PCR;一份放入4%甲醛,用于病理學(xué)檢測。
2.2 血清淀粉酶(amylase,AMS)測定 采用碘-淀粉比色法,操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行,由美國Vitros-250型全自動生化分析儀測定。
2.3 血清FKN ELISA檢測 取出酶標(biāo)板,設(shè)空白孔,依次加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣本血清各100 μL于包被好抗大鼠FKN單抗的各孔中,37℃孵育2 h,然后嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行洗板操作,分別加入生物素化的Ⅰ抗、辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈霉親和素及底物甲基聯(lián)苯胺溶液,經(jīng)終止液作用后30 min內(nèi)用Therm。MK3型酶標(biāo)儀在450nm處測吸光度值(A值)。
2.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測 ?。?0℃冷凍保存的組織50-100 mg用RNAiso Plus試劑,嚴(yán)格按操作手冊提取胰腺和肺組織總RNA,采用紫外分光光度法定量RNA。用PrimeScriptTMRT試劑盒合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄體系包括1 μL總 NRA;2 μL 5×逆轉(zhuǎn)錄buffer;0.5 μL oligo dT;0.5 μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I,加 DEPC 水至總體積 10 μL,反應(yīng)條件如下:37℃ 15 min;85℃ 5 s。自行設(shè)計大鼠GAPDH及CX3CL1引物各一對,F(xiàn)KN上游引物5'-TGCCACAAGATGACCTCGCCA -3',下游引物 5'-TCCAGGTGCTTCATGGCGTCT-3',擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為164 bp;GAPDH上游引物 5'-AAGGTGGTGAAGCAGGCGGC -3’,下游引物5'-GAGCAATGCCAGCCCCAGCA-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為130 bp。取2 μL cDNA模板進(jìn)行 RT-qPCR,加入 SYBR premix Ex Taq 12.5 μL,引物各 0.5 μL,再加入滅菌蒸餾水使反應(yīng)體積為25 μL。PCR反應(yīng)采用兩步法,條件為:預(yù)變性95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個循環(huán),然后進(jìn)入熔解曲線測定程序。最后計算ΔCt值和RQ值。
2.5 組織病理學(xué)檢查 所有大鼠處死后均做病理檢查,所取的胰腺組織和肺組織標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋,5 μ厚切片,行HE染色,進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。胰腺組織和肺組織病理學(xué)評分及分級,均由2位專業(yè)的病理醫(yī)師雙盲閱片,每組隨機(jī)取3張切片,每張切片隨機(jī)選取10個高倍鏡視野,以水腫、感染、出血和壞死評價胰腺組織損傷的程度。胰腺組織具體參考Rongione等[4]的評分標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行病理評分,各項最低分為0分,最高分為4分,取各項積分總和為最終得分。肺組織病理學(xué)評級具體參考雷文章等[5]的評級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評級,最低級為0級,最高級為Ⅲ級。
SAP 和UT 組1 h、3 h、6 h、12 h 各亞組血清淀粉酶活性與對照組比較均明顯升高,差異顯著(P<0.01);UT組與SAP組相比較,1 h和3 h兩亞組間沒有顯著差異(P>0.05);而6 h和12 h,UT組血清淀粉酶活性升高程度比SAP組顯著減低(P<0.01),見表1。
表1 各組不同時點(diǎn)血清淀粉酶活性的變化Table 1.Changes of serum amylase activity in each group at various time points(U/L..n=6)
表1 各組不同時點(diǎn)血清淀粉酶活性的變化Table 1.Changes of serum amylase activity in each group at various time points(U/L..n=6)
**P <0.01 vs control group;##P <0.01 vs SAP group.
Control 725±129 1646±144 2004±107 2168±140 SAP 2441±218** 3552±283** 6576±265** 7666±409**SAP+UT 2176±220** 3260±182** 4672±236**##4952±208**##
SAP組血清FKN水平隨時間變化逐漸升高,在1 h時點(diǎn),3組間血清FKN水平變化無顯著差異(P>0.05);SAP組在3h、6h和12h血清FKN水平高于對照組,差異顯著(P<0.05),而UT組與對照組之間血清FKN水平差異無顯著(P>0.05),SAP組與UT組血清FKN水平在6 h和12 h時,顯著差異,見表2。
表2 各組不同時點(diǎn)血清FKN濃度的變化Table 2.Changes of serum FKN level in each group at various time points(ng/L..n=6)
表2 各組不同時點(diǎn)血清FKN濃度的變化Table 2.Changes of serum FKN level in each group at various time points(ng/L..n=6)
*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs SAP group.
Group 1 h 3 h 6 h 12 h Control 115.6 ±6.5 140.1±5.3 147.8±5.7 168.4±5.9 SAP 121.7 ±5.1 172.4±8.7* 188.6±11.9* 240.8 ±10.1*SAP+UT 118.1 ±9.3 150.2±5.6 153.2±4.6# 175.1 ±10.3#
SAP組胰腺組織FKN mRNA的表達(dá)隨時間變化逐漸升高,SAP組1h與對照組相比無顯著差異,3 h表達(dá)高于對照組(P<0.05),6和12 h表達(dá)顯著高于對照組(P<0.01);UT組各時點(diǎn)與對照組相比均無顯著差異,UT組3 h、6 h和12 h時點(diǎn)胰腺組織FKN mRNA表達(dá)均低于SAP組,見表3。
表3 各組不同時點(diǎn)胰腺組織中FKN mRNA表達(dá)的變化Table 3.Changes of FKN mRNA expression in pancreas in each group at various time points(.n=6)
表3 各組不同時點(diǎn)胰腺組織中FKN mRNA表達(dá)的變化Table 3.Changes of FKN mRNA expression in pancreas in each group at various time points(.n=6)
*P <0.05,**P <0.01 vs control group;#P <0.05 vs SAP group.
Group 1 h 3 h 6 h 12 h Control 0.15±0.02 0.25±0.04 0.38±0.04 0.49±0.04 SAP 0.15±0.01 0.32±0.02* 0.50±0.05** 0.78±0.04**SAP+UT 0.16±0.10 0.25±0.03# 0.40±0.03# 0.59±0.05#
SAP組肺組織FKN mRNA的表達(dá)隨時間變化逐漸升高,SAP組1 h與對照組相比無顯著差異,3 h、6 h和12 h表達(dá)顯著高于對照組(P<0.01);UT組3 h、6 h和12 h時點(diǎn)肺組織FKN mRNA的表達(dá)均低于SAP組的表達(dá);UT組與對照組相比較,各時點(diǎn)無顯著差異,見表4。
表4 各組不同時點(diǎn)肺組織FKN mRNA表達(dá)的變化Table 4.Changes of FKN mRNA expression in lung in each group at various time points(.n=6)
表4 各組不同時點(diǎn)肺組織FKN mRNA表達(dá)的變化Table 4.Changes of FKN mRNA expression in lung in each group at various time points(.n=6)
*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs SAP group.
Group 1 h 3 h 6 h 12 h 0.06 SAP 0.13±0.03 0.34±0.06* 0.46 ±0.07* 0.68±0.06*SAP+UT 0.12±0.02 0.23±0.03# 0.39±0.05# 0.46±0.05 Control 0.11±0.02 0.19±0.04 0.28 ±0.05 0.38±#
對照組大鼠胰腺光鏡下細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚、完整,小葉界限明確,間質(zhì)無水腫,但是有少量炎癥細(xì)胞浸潤,偶見點(diǎn)狀出血,極少量腺泡細(xì)胞壞死。
SAP組術(shù)后1 h、3 h可見明顯小葉間水腫,片狀出血,炎癥細(xì)胞浸潤,部分腺泡細(xì)胞變性、壞死;術(shù)后6 h、12 h可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,片狀出血,胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞,大量腺泡細(xì)胞壞死。胰腺組織HE染色,光鏡下可見胰腺實(shí)質(zhì)大片壞死,間質(zhì)出血并有大量炎癥細(xì)胞浸潤,小葉輪廓破壞。
UT組1 h、3 h可見胰腺間質(zhì)輕度水腫,6 h除間質(zhì)水腫外,有炎癥細(xì)胞浸潤及點(diǎn)狀出血壞死,12 h炎癥細(xì)胞浸潤進(jìn)一步增加,有局灶壞死。UT組各時點(diǎn)與SAP組相比,胰腺病理損傷明顯減輕;光鏡下可見胰腺實(shí)質(zhì)有小片狀壞死灶,間質(zhì)出血并仍有較多的炎癥細(xì)胞浸潤。各組不同時點(diǎn)胰腺組織病理評分見表5。
表5 各組不同時點(diǎn)胰腺組織病理評分Table 5.Pathological scores of pancreatic tissues in each group at various time point(.n=6)
表5 各組不同時點(diǎn)胰腺組織病理評分Table 5.Pathological scores of pancreatic tissues in each group at various time point(.n=6)
**P <0.01 vs control group;#P <0.05 vs SAP group.
Group 1 h 3 h 6 h 12 h Control 1.89±0.23 1.96±0.14 2.37±0.36 3.08±0.27 SAP 5.73±0.35** 7.40±0.21** 10.22±0.43** 11.15±0.81**SAP+UT 3.29±0.30 4.13±0.27 6.34±0.51# 7.62±0.42#
對照組各時點(diǎn)肺組織未見明顯水腫及炎癥細(xì)胞浸潤,亦未見出血和肺泡細(xì)胞壞死。光鏡下見肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,肺泡內(nèi)未見明顯滲出液。
SAP組術(shù)后1 h亦未見明顯變化,組織病理評級為0級;術(shù)后3 h可見肺間質(zhì)水腫,少量炎癥細(xì)胞浸潤,偶見點(diǎn)狀出血和肺泡細(xì)胞壞死,組織病理學(xué)評級為Ⅰ級;術(shù)后6 h見肺泡隔增寬,肺內(nèi)小血管擴(kuò)張充血,有較多的中性粒細(xì)胞浸潤,組織病理學(xué)評級為Ⅱ級;術(shù)后12 h鏡下見肺間質(zhì)水腫,彌漫性出血,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,大量肺泡細(xì)胞壞死。血管擴(kuò)張瘀血,有大量炎癥細(xì)胞浸潤,組織病理學(xué)評級為Ⅲ級。
UT組各時點(diǎn)肺病理學(xué)改變與SAP組相比,3 h后各時點(diǎn)癥狀明顯減輕,未見斑片狀壞死,肺泡間隔變薄,仍有一些炎癥細(xì)胞浸潤,以中性粒細(xì)胞為主,組織病理學(xué)評級為I級。
SAP是消化系統(tǒng)的急腹癥,病程兇險,發(fā)展快,死亡率高[6,7]。其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了,目前認(rèn)為在其形成過程中,炎癥細(xì)胞的浸潤起著重要作用,在發(fā)病早期階段就可出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)且并發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),造成胰腺以外的重要臟器發(fā)生功能性和器質(zhì)性的損傷[6]。本實(shí)驗結(jié)果表明,SAP組和對照組術(shù)后1 h,胰腺組織中FKN mRNA表達(dá)水平升高不明顯,與對照組相比,無顯著差異。然而SAP大鼠術(shù)后3 h-12 h胰腺組織中FKN mRNA的表達(dá)明顯高于對照組,顯著差異。此時我們從病理切片中觀察到胰腺組織的病理損害程度不斷加重,提示FKN可能在SAP發(fā)病過程中起了重要作用。研究表明[8-10],急性胰腺炎(AP)時受損的胰腺組織作為抗原或炎癥刺激物激活巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子,進(jìn)而通過扳機(jī)樣作用,觸發(fā)炎癥介質(zhì)瀑布樣級聯(lián)反應(yīng),細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和免疫功能紊亂很可能是AP極易從局部病變迅速發(fā)展為SIRS和多器官功能衰竭(multiple organ failure,MOF)的實(shí)質(zhì)所在。
趨化因子是一類控制細(xì)胞定向遷移的細(xì)胞因子,其功能的行使由趨化因子受體介導(dǎo),趨化因子與其受體的相互作用控制著各種免疫細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)和組織器官間的定向遷移,使免疫細(xì)胞到達(dá)感染部位,執(zhí)行清除感染,維持組織細(xì)胞平衡的功能。本實(shí)驗中,模型組血清中FKN水平隨著時間的延長不斷增高,SAP組和對照組術(shù)后1 h,血清中檢測到有少量的FKN表達(dá);SAP大鼠術(shù)后3 h-12 h檢測到血清FKN水平不斷升高,與對照組相比差異顯著。提示牛磺膽酸鈉的作用,使胰腺組織不斷釋放出趨化因子FKN并進(jìn)入血流。循環(huán)中的FKN因子對中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等均有趨化作用,使機(jī)體內(nèi)大量炎癥細(xì)胞不斷進(jìn)入炎癥組織。此時我們病理組織切片觀察到,在3 h-12 h的胰腺組織中有大量炎癥細(xì)胞浸潤,并伴有胰腺組織的壞死。隨著時間的延長,胰腺組織病理學(xué)積分也不斷增高。我們推測,F(xiàn)KN因子的大量滲出進(jìn)入血流,誘導(dǎo)了大量炎癥細(xì)胞游走進(jìn)入胰腺組織,促進(jìn)了炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展,從而導(dǎo)致了大量胰腺腺泡細(xì)胞的壞死。
UT是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種糖蛋白。UT屬于蛋白酶抑制劑,不僅對胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等多種酶有抑制作用,還具有穩(wěn)定溶酶體膜,抑制溶酶體酶的釋放,清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。本研究結(jié)果顯示,我們在大鼠SAP模型建立后立即皮下注射UT,6 h后血清淀粉酶顯著下降,胰腺組織病理改變明顯減輕,提示UT對SAP有較明顯的治療作用。我們還注意到,經(jīng)熒光定量PCR檢測胰腺組織FKN mRNA的表達(dá),在3 h后B組胰腺組織中FKN mRNA表達(dá)較A組胰腺組織中表達(dá)減弱,檢測其血清中FKN蛋白的含量,B組血清FKN的含量也較A組血清明顯降低。提示UT能顯著改善大鼠SAP嚴(yán)重程度,其機(jī)制可能與抑制了趨化因子FKN表達(dá)有一定關(guān)系。
急性胰腺炎相關(guān)的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是急性胰腺炎SIRS在肺部的表現(xiàn),嚴(yán)重者出現(xiàn)急性呼吸性窘迫綜合征(ARDS)和MODS。SAP合并ALI,病情兇險,死亡率高,約1/3的SAP合并ALI和ARDS,并且約60%死亡病例是由后2種并發(fā)癥引起[11-13]。本實(shí)驗中我們觀察到,SAP大鼠術(shù)后1 h肺部FKN mRNA表達(dá)開始升高,但此時統(tǒng)計學(xué)分析兩者間無顯著差異。病理切片組織學(xué)觀察顯示此時未見明顯變化。SAP大鼠術(shù)后3 h-12 h檢測肺部組織FKN mRNA表達(dá)與對照組比較,明顯增加,此時病理組織學(xué)觀察顯示,在3 h時點(diǎn)可見到有少量炎癥細(xì)胞浸潤及肺間質(zhì)水腫等病理現(xiàn)象。術(shù)后6 h-12 h可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,并伴有水腫、出血和細(xì)胞壞死。提示FKN在SAP相關(guān)的ALI中起了重要作用。同時,本研究結(jié)果顯示SAP大鼠術(shù)后3 h FKN就在肺組織內(nèi)明顯表達(dá)。而我們早先對MCP-1在大鼠急性胰腺炎肺損害中的作用研究顯示,MCP-1在大鼠術(shù)后3 h肺組織內(nèi)表達(dá)尚未明顯升高[14,15],提示FKN很可能較早參與了AP相關(guān)的ALI的發(fā)生,這一結(jié)果為研究急性胰腺炎相關(guān)ALI的發(fā)生機(jī)制提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。
我們在研究中注意到,隨著實(shí)驗時間的延長,各實(shí)驗對照組的結(jié)果也隨之增高。造成這樣的結(jié)果我們認(rèn)為可能有兩個原因,一是由于手術(shù)創(chuàng)傷引起對照組趨化因子表達(dá)水平的增高;二是由于在造模過程中我們采用的是逆向膽胰管內(nèi)注射的方法,膽胰管損傷及逆向注射時一定的壓力可能會引起局部組織損傷,也可能會導(dǎo)致各對照組實(shí)驗結(jié)果的增高。我們認(rèn)為這一結(jié)果比較客觀地反映了實(shí)驗過程中其它因素對實(shí)驗結(jié)果的影響,實(shí)驗對照組是實(shí)驗設(shè)計中必不可少的。
趨化因子及其受體的表達(dá)及功能異常將導(dǎo)致免疫細(xì)胞不能在正常位置行使其正常功能。因此,以趨化因子及其受體分子為治療靶點(diǎn),通過激活或者拮抗趨化因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控趨化因子系統(tǒng)的功能,可望用于控制和治療相關(guān)疾病。
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