p38 MAPK信號通路在雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺AR42J細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用

陸邦超，鄒大進(jìn)

(第二軍醫(yī)大學(xué)南京臨床醫(yī)學(xué)院，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210002)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見的危重疾病，起病急驟，病情發(fā)展迅速，病死率較高，特別是重癥急性胰腺炎(SAP)機(jī)制復(fù)雜、治療困難，病死率高達(dá)30% －50%[1，2]。目前認(rèn)為AP的發(fā)病包含有復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，始于胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)[3]。疾病早期階段胰腺腺泡細(xì)胞產(chǎn)生的前炎癥細(xì)胞因子和化學(xué)趨化因子，不僅造成了胰腺細(xì)胞自身損傷，同時募集了體內(nèi)大量炎癥細(xì)胞向胰腺的浸潤，進(jìn)而導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)以及多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。因此對胰腺腺泡細(xì)胞早期事件的了解，有助于闡明AP的發(fā)病機(jī)制。p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族中的重要成員之一。p38 MAPK通路的激活可促進(jìn)TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8等多種促炎因子的表達(dá)和釋放，被認(rèn)為是調(diào)控炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[4]，與急性胰腺炎，尤其是急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。且研究發(fā)現(xiàn)p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappaB，NF－κB)信號途徑可能存在著交匯作用，相互影響[5，6]。目前國內(nèi)外學(xué)者多采用制造各種體內(nèi)動物模型對急性胰腺炎進(jìn)行研究，急性胰腺炎的體外研究較少見。本研究采用雨蛙素刺激AR42J細(xì)胞構(gòu)建急性胰腺炎的體外模型，探討p38 MAPK信號分子在其炎癥細(xì)胞因子表達(dá)方面的作用及其可能機(jī)制，以期為急性胰腺炎發(fā)病的分子機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J細(xì)胞株(購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，No.GDC147);含有血清的完全培養(yǎng)基(RPMI－1640)和 p38 MAPK 抑制劑 SB203580[7]購自 Sigma;血清淀粉酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;p－p38 MAPK、TNF－α和NF－κB檢測試劑盒購自碧云天公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組 大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J細(xì)胞株用含有血清的RPMI－1640置于37℃溫箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長到2.5×109cells/L時進(jìn)行傳代。將細(xì)胞接種于6孔板中，饑餓培養(yǎng)使細(xì)胞同步化，分為3組:(1)正常對照組:細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng);(2)雨蛙素組:培養(yǎng)皿內(nèi)加入等量DMSO，30 min后加入10－8mol/L雨蛙素進(jìn)行培養(yǎng);(3)p38 MAPK抑制劑SB203580 組:培養(yǎng)皿內(nèi)加入 SB20358010 μmol/L，30 min 后加入10－8mol/L雨蛙素進(jìn)行培養(yǎng)。3 h后取標(biāo)本檢測相關(guān)指標(biāo)，每組設(shè)3個樣本，實驗重復(fù)3次。

2.2 懸浮細(xì)胞免疫熒光染色 取100 μL細(xì)胞懸液滴至1.5 mL EP管中，每管中加入甲醛溶液200 μL，室溫靜置20 min。3000×g離心3 min，吸出固定液，加入1 mL雙蒸水，放置5 min，然后3000×g離心5 min，吸出雙蒸水后加入200 μL TPBS，室溫放置20 min，PBS 洗3 遍。加入Ⅰ抗，37 ℃孵育1 h后，用PBS洗3遍，加入Ⅱ抗，37℃孵育30 min，PBS洗滌3遍，加DAPI使終濃度為20 mg/L染色3 min。將處理好的細(xì)胞懸液滴在載玻片上，甘油封片后立即進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.3 細(xì)胞淀粉酶分泌率 采用酶動力學(xué)方法，分別測定腺泡細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清中的淀粉酶，淀粉酶分泌率=(細(xì)胞上清淀粉酶/細(xì)胞總淀粉酶)×100%。

2.4 Western blotting測定腺泡細(xì)胞p－p38 MAPK和TNF－α表達(dá) 按照操作說明用細(xì)胞裂解液抽提胞漿蛋白，以Bardford法測定胞漿總蛋白;按20 μg蛋白樣本/孔進(jìn)行 SDSPAGE電泳，結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;以50 g/L脫脂奶粉的1×TBST溶液室溫封閉PVDF膜;p－p38 MAPK和TNF－αⅠ抗溫育，洗膜;IgG－HRPⅡ抗溫育，洗膜，加ECL發(fā)光劑對膠片曝光;使用凝膠成像分析系統(tǒng)對目的條帶進(jìn)行掃描和密度分析，以相應(yīng)蛋白條帶的平均吸光度值來表示p－p38 MAPK和TNF－α水平的相對強(qiáng)度。

2.5 凝膠電泳遷移率(electrophoretic mobility assay，EMSA)測定腺泡細(xì)胞NF－κB活性 (1)按低鹽溶解繼以高鹽提取法提取核蛋白。(2)采用Bardford法測定胞漿總蛋白。(3)標(biāo)記NF－κB寡核苷酸探針:5 pmol/L NF－κB寡核苷酸探針(5'－AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC－3')在10U T4多核苷酸激酶作用下，加入5 U γ－[32P]ATP，于37℃反應(yīng)10 min，加入1 μL的0.5 mol/L EDTA終止反應(yīng)。(4)采用4%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。(5)DNA結(jié)合反應(yīng):核蛋白(30 μg)與2 μL結(jié)合緩沖液在9 μL總反應(yīng)體積中室溫下反應(yīng)10 min，加入[32P]標(biāo)記的NF－κB寡核苷酸探針1 μL后室溫下繼續(xù)反應(yīng)20 min。加入1 μL的上樣緩沖液終止反應(yīng)。(6)DNA蛋白復(fù)合物電泳:將4%非變性聚丙烯酰胺在0.5×TBE，380 V電壓下預(yù)電泳10 min，加樣后繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)移至膠全長3/4處。將膠真空干燥后，暗室內(nèi)放入X光片盒內(nèi)，－70℃曝光24－48 h。用Imagel圖像分析灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 胰腺腺泡細(xì)胞P38活化后的核移位

正常AR42J細(xì)胞飽滿，邊界清楚，折光性強(qiáng)。細(xì)胞呈簇狀聚集成團(tuán)，不貼壁。細(xì)胞質(zhì)中有P38激酶蛋白熒光弱熒光表達(dá)，細(xì)胞核呈“核空染”狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到雨蛙素刺激后，細(xì)胞明顯收縮變形，主要是細(xì)胞膜收縮變皺。p38蛋白熒光變強(qiáng)，區(qū)域幾乎分布于整個細(xì)胞，細(xì)胞核中亦有明顯顯現(xiàn)。提示p38由胞漿向胞核移位。SB203580組細(xì)胞分布較散在，p38蛋白熒光區(qū)域幾乎分布于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中未見有明顯顯現(xiàn)，見圖1。

Figure1.The translocation of p－p38 MAPK to nuclei was imaged by immunofluorescence(×200).A:normal group;B:cerulein group;C:SB203580 group.圖1 免疫熒光染色觀察p－p38 MAPK核移位

2 胰腺腺泡細(xì)胞淀粉酶分泌率

雨蛙素組胰腺腺泡細(xì)胞淀粉酶分泌率顯著高于對照組(P＜0.01);SB203580組淀粉酶分泌率均較雨蛙素組顯著降低(P ＜0.01)，見表1。

表1 各組AR42J細(xì)胞淀粉酶分泌率Table1.Secretion rates of amylase in AR42J cells(%..n=9)

表1 各組AR42J細(xì)胞淀粉酶分泌率Table1.Secretion rates of amylase in AR42J cells(%..n=9)

＊＊P ＜0.01 vs normal;##P ＜0.01 vs cerulein group.

Group Secretion rate of amylase Normal 13.18 ±0.39 Cerulein 40.41 ±1.16＊＊SB203580 29.88 ±1.26＊＊##

3 胰腺腺泡細(xì)胞p－p38 MAPK和TNF－α表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示總p38 MAPK蛋白各組無差別。正常對照組中p－p38 MAPK(0.22±0.12)和TNF－α(0.59±0.12)蛋白表達(dá)量較低。與正常對照組相比，雨蛙素組p－p38 MAPK蛋白(0.52±0.19)、TNF－α蛋白(1.62±0.27)表達(dá)量明顯增高(均P＜0.01)。而與雨蛙素組相比，SB203580組p－p38 MAPK(0.39±0.10)和TNF－α(1.08±0.10)均降低(P ＜0.05，P＜0.01)，見圖2、3。

Figure2.p－p38 MAPK protein expression in AR42J cells detected by Western blotting.Lane 1:normal group;Lane 2:cerulein group;Lane 3:SB203580 group.圖2 Western blotting檢測AR42J細(xì)胞p－p38 MAPK蛋白表達(dá)

Figure3.TNF－α protein expression in AR42J cells detected by Western blotting.Lane 1:normal group;Lane 2:cerulein group;Lane 3:SB203580 group.圖3 Western blotting檢測AR42J細(xì)胞TNF－α蛋白表達(dá)

4 胰腺腺泡細(xì)胞NF－κB的活性

正常對照組中NF－κB活性較低(87.32±10.71)。雨蛙素組(138.83±7.87)較正常對照組NF－κB活性明顯增高(P＜0.01)。SB203580組(111.26±9.39)較雨蛙素組降低(P ＜0.01)，見圖4。

討 論

AR42J細(xì)胞為大鼠胰腺腺泡細(xì)胞株，具有同正常胰腺腺泡細(xì)胞一樣的受體表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。所以，該細(xì)胞株被廣泛地應(yīng)用于離體實驗中，用來研究內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞的分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架功能、凋亡和胰腺的炎癥反應(yīng)。眾所周知，過量的雨蛙素刺激AR42J細(xì)胞可以快速誘導(dǎo)產(chǎn)生急性胰腺炎，具有高度的可重復(fù)性。這個促分泌劑誘導(dǎo)的細(xì)胞模型是觀察胰腺病理生理事件良好的體外模型[8]。

MAPK是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，已證實[9，10]，MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號到細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞反應(yīng)的四大信號系統(tǒng)之一，其參與了細(xì)胞生長、發(fā)育及細(xì)胞間功能同步等多種生理過程。其中p38 MAPK信號通路與炎癥反應(yīng)調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)，其靜息狀態(tài)下主要分布于細(xì)胞漿，激活后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等各種效應(yīng)基因的表達(dá)。大量研究表明[5，11，12]，p38MAPK在AP大量活化，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子TNF－α、1L－lβ、IL－8等的表達(dá)，使炎癥反應(yīng)調(diào)控失衡，導(dǎo)致級聯(lián)“瀑布”效應(yīng)。p38 MAPK信號通路不但與胰腺本身的病程發(fā)展相關(guān)，而且可能參與急性肺損傷的發(fā)生[13，14]。應(yīng)用p38 MAPK阻滯劑能明顯抑制炎癥因子的釋放，改善胰腺及肺組織的病理損傷[15]，減輕胰腺炎的病情，提高術(shù)后生存率[16]。

Figure4.NF－κB activation in AR42J cells detected by electrophoretic mobility assay.Lane 1:normal group;Lane 2:cerulein group;Lane 3:SB203580 group.圖4 EMSA檢測AR42J細(xì)胞NF－κB活性

本實驗予雨蛙素刺激胰腺 AR42J細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn) p38 MAPK被激活，其蛋白磷酸化水平增高，p－p38 MAPK由細(xì)胞漿向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)了炎癥細(xì)胞因子TNF－α的生成，加重了細(xì)胞的損傷(淀粉酶分泌增高)。該結(jié)果與 Blinman等[5]實驗結(jié)果一致。采用p38 MAPK抑制劑SB203580后，能明顯降低胰腺細(xì)胞TNF－α和淀粉酶的生成，減輕胰腺細(xì)胞損傷。而且實驗發(fā)現(xiàn)SB203580可以使AR42J細(xì)胞NF－κB的轉(zhuǎn)錄水平下降，抑制其NF－κB的活性。這提示p38 MAPK信號通路還參與了雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎胰腺細(xì)胞的NF－κB的活化。

本實驗結(jié)果表明p38 MAPK信號通路在急性胰腺炎胰腺細(xì)胞中即被激活，上調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，在胰腺局部損傷中發(fā)揮重要作用。p38 MAPK信號通路還參與了胰腺細(xì)胞NF－κB的活化，而不斷產(chǎn)生的炎性因子使炎癥反應(yīng)調(diào)控失衡，導(dǎo)致級聯(lián)“瀑布”效應(yīng)，使局部炎癥向全身發(fā)展提供了契機(jī)。因此，p38 MAPK信號的活化可能是急性胰腺炎胰腺損傷的重要發(fā)病機(jī)制，而p38 MAPK抑制劑顯示出的抗炎效應(yīng)無疑為治療急性胰腺炎提供了一條新的思路。

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