曾可靜， 李 萡△， 牛宇哲， 劉思初， 陳少華， 楊力建，左璨粲， 孫潤(rùn)陸， 梁趙佳， 陳嘉榆， 余 衛(wèi)， 李揚(yáng)秋

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東廣州510632;2廣州市第十二人民醫(yī)院，廣東廣州510620)

苯在工業(yè)上用途很廣，慢性苯中毒是常見的一種職業(yè)病?，F(xiàn)多項(xiàng)研究已表明苯對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)造成損傷，機(jī)體免疫功能缺陷表現(xiàn)為對(duì)致病性微生物抵抗力下降導(dǎo)致感染性疾病;對(duì)機(jī)體異常細(xì)胞清除能力下降導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。免疫功能的下降也必然與免疫應(yīng)答環(huán)節(jié)密切相關(guān)。有研究表明免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是Th1/Th2分化失衡，其與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有關(guān)。而轉(zhuǎn)錄因子T-bet(T-box expressed in T cells)和GATA-3(GATA binding protein-3)分別作為Th1和Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子受到廣泛關(guān)注[1]。T-bet和GATA-3分別特異性地表達(dá)于Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，并最終影響Th0向Th1/Th2的分化。另外，T-bet與GATA-3均可形成自我激活的反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，構(gòu)成一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[2]。鑒于目前對(duì)接觸苯后細(xì)胞免疫狀態(tài)了解的不足，我們通過探究外周血中T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3 mRNA表達(dá)情況，以期為接觸后致血液系統(tǒng)疾病研究提供新的資料。

材料和方法

1 研究對(duì)象

采集職業(yè)苯接觸工人外周血標(biāo)本25例，其中女性12名，男性13名，年齡20-62歲，平均(34.5±10.3)歲，工齡0.5-33歲，平均(10.5±9.8)年;慢性苯中毒工人外周血標(biāo)本27例，其中女性16例，男性11例，年齡19-54歲，平均(35.1±10.9)歲，工齡1-35年，平均(8.2±8.0)年;健康體檢者外周血標(biāo)本20例，其中女性10例，男性10例，年齡20-57歲，平均(33.9±10.5)歲。苯接觸和慢性苯中毒外周血標(biāo)本均由廣州市第十二人民醫(yī)院提供。苯接觸及慢性苯中毒工人均有職業(yè)接觸苯史。接觸苯、苯中毒工人和健康體檢者均無影響造血和免疫功能的基礎(chǔ)疾患、首次就診3個(gè)月內(nèi)未使用影響造血和免疫功能的藥物、無癌癥史、放療及化療史、無其它骨髓毒性化學(xué)物接觸史和放射線接觸史。

2 方法

2.1 RNA提取和cDNA合成 按常規(guī)方法分離采集肝素抗凝外周血標(biāo)本中單個(gè)核細(xì)胞。RNA提取應(yīng)用Trizol試劑盒(Invitrogen)并應(yīng)用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑(Power ScriptTMReverse，BD)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈均按常規(guī)方法進(jìn)行。

2.2 引物設(shè)計(jì) GATA-3上游引物5'-TGGCACGGGACACTACCTG-3'，下游引物 5'-TCCCCATTGGCATTCCTC-3，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度174 bp。T-bet上游引物5'-ATGTGACCCAGATGATTGTGC-3'，下 游 引 物 5'-AAAGATATGCGTGTTGGAAGC-3'，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度119 bp。EEF內(nèi)參上游引物5'-ATGTGACCCAGATGATTGTGC-3'，下游引物5'-AAAGATATGCGTGTTGGAAGC-3'，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度100 bp。引物均由上海生工合成。

2.3 SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR 在擴(kuò)增效率一致性檢測(cè)方法建立的基礎(chǔ)上，每一標(biāo)本分別進(jìn)行T-bet和GATA-3以及EEF mRNA表達(dá)情況檢測(cè)?？偡磻?yīng)體積為25 μL，包括Real Master Mix 11.25 μL，0.4 mmol/L 上、下游引物1 μL等。95℃ 2 min變性，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，每一循環(huán)包括95℃15 s，60℃ 1 min。GATA-3 mRNA在84℃讀板，T-bet在82℃讀板。記錄1次熒光值，獲得熔解曲線。反應(yīng)在Chromo 4熒光定量PCR儀中進(jìn)行。

2.4 PCR產(chǎn)物分析 對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析，同時(shí)進(jìn)行20g/L瓊脂糖凝膠電泳，以確定產(chǎn)物是否為所擴(kuò)增的目的片段。

2.5 T-bet和GATA-3 mRNA相對(duì)定量分析 采用相對(duì)定量法分別分析接觸苯、苯中毒工人與正常人相比較T-bet和GATA-3 mRNA差異表達(dá)。以EEF為內(nèi)參照，利用實(shí)時(shí)定量PCR獲得的T-bet和GATA-3 mRNA和EEF mRNA Ct值，采用相對(duì)定量法(2-ΔCt×100%，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)計(jì)算苯接觸、苯中毒工人與正常人T-bet和GATA-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

結(jié) 果

1 T－bet和GATA－3表達(dá)產(chǎn)物的確定分析

通過瓊脂糖凝膠電泳分析顯示PCR產(chǎn)物片段大小正確。所有標(biāo)本的EEF mRNA產(chǎn)物熔解曲線峰值均在81℃，正常人T-bet和GATA-3 mRNA產(chǎn)物熔解曲線峰值均分別在82℃和84℃。而個(gè)別接觸苯、苯中毒工人T-bet和GATA-3 mRNA產(chǎn)物的熔解曲線則會(huì)出現(xiàn)多個(gè)不同寬度的峰。

2 苯接觸及苯中毒工人外周血中T－bet和GATA－3表達(dá)情況

GATA-3在正常人的表達(dá)水平為0.39±0.22，與正常組對(duì)照比較職業(yè)接觸苯工人組中有19例GATA-3表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)(0.57±0.54)，慢性苯中毒工人組中則有20例GATA-3表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)(0.52±0.50)。此外，在職業(yè)接觸苯工人組中發(fā)現(xiàn)6例GATA-3表達(dá)水平顯著下降(0.15±0.12，P＜0.05)，同樣在慢性苯中毒工人組中也有7例GA-TA-3表達(dá)水平顯著下降(0.07±0.06，P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of GATA-3 mRNA in PBMCs from 20 normal individuals，25 benzene-exposed workers and 27 benzene poisoning workers.N:normal;BEGI:benzene-exposed group with increased expression of GATA-3(n=19);BPGI:benzene poisoning group with increased expression of GATA-3(n=20);BEGD:benzene-exposed group with decreased expression of GATA-3(n=6);BPGD:benzene poisoning group with decreased expression of GATA-3(n=7).*P＜0.05 vs normal.圖1 職業(yè)接觸苯和慢性苯中毒患者及正常人PBMCs中GATA－3 mRNA的表達(dá)

T-bet在正常人的表達(dá)水平為2.15±1.45，與正常組對(duì)照比較職業(yè)接觸苯工人組中有19例T-bet表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)(1.91±1.49)，在慢性苯中毒工人組27例T-bet表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)(1.52±0.56)。此外，在職業(yè)接觸苯工人組中也可發(fā)現(xiàn)6例T-bet表達(dá)水平顯著上升(3.19±2.10，P ＜0.05)，見圖2。

綜合分析2組樣本中2個(gè)基因表達(dá)變化特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，大部分職業(yè)接觸苯和慢性苯中毒工人外周血中GATA-3和T-bet表達(dá)模式是GATA-3表達(dá)水平上升伴T-bet表達(dá)水平下降趨勢(shì)。但28%的職業(yè)接觸苯工人的GATA-3表達(dá)下降伴T-bet表達(dá)水平上升相反的趨勢(shì);約22%的慢性苯中毒工人GATA-3表達(dá)水平顯著下降。這種雙向表達(dá)變化特點(diǎn)在GATA-3中可同時(shí)見于苯接觸和苯中毒組樣本，而在T-bet則僅見于苯接觸組。大部分苯接觸和苯中毒工人中T-bet/GATA-3比值分別為4.17±2.17和4.01±2.03，與對(duì)照組(6.15±3.73)相比有下降的趨勢(shì)。而在6例接觸苯工人T-bet/GATA-3比值(42.7±40.1)呈相反趨勢(shì)變化，與對(duì)照組相比明顯上升(P＜0.05);同樣7例苯中毒工人的上述2個(gè)基因表達(dá)水平均下降的T-bet/GATA-3為24.95±14.10，與對(duì)照組相比也明顯上升(P＜0.05)。

Figure 2.The expression of T-bet mRNA in PBMCs from 20 normal individuals，25 benzene-exposed workers and 27 benzene poisoning workers.N:normal;BETD:benzene-exposed group with decreased expression of T-bet(n=19);BPTD:benzene poisoning group with decreased expression of T-bet;BETI:benzene-exposed group with increased expression of T-bet(n=6)*P＜0.05 vs normal.圖2 職業(yè)接觸苯和慢性苯中毒患者及正常人PBMCs中T－bet mRNA的表達(dá)

討 論

苯是目前應(yīng)用最為廣泛的化工原料和工業(yè)溶劑之一。隊(duì)列研究證明職業(yè)接觸苯人群發(fā)生血液淋巴系統(tǒng)惡性疾病的相對(duì)危險(xiǎn)性明顯增加。吸入苯后的毒性主要與其代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，有關(guān)慢性苯中毒以及苯致再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)和白血病確切發(fā)病機(jī)制仍不明確。普遍認(rèn)為是多因素、多水平綜合作用的結(jié)果。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)了苯接觸對(duì)于T細(xì)胞譜系的分布，T細(xì)胞克隆性增殖和胸腺近期輸出功能以及T細(xì)胞活化過程都有影響[3-5]。由于T細(xì)胞調(diào)節(jié)的變化同樣影響機(jī)體的正常T細(xì)胞免疫功能，其調(diào)節(jié)異常與自身免疫性疾病的發(fā)生和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析苯接觸是否對(duì)機(jī)體Th1和Th2型細(xì)胞的平衡產(chǎn)生影響。

T-bet和GATA-3基因所編碼的轉(zhuǎn)錄因子分別作為Th1和Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，T-bet和GATA-3失衡與一些疾病，包括自身免疫性疾病的發(fā)生及進(jìn)展有著密切聯(lián)系[6]。因此，本研究通過對(duì)這2個(gè)基因的表達(dá)變化分析初步了解苯接觸和苯中毒對(duì)Th1和Th2型細(xì)胞的平衡的影響情況。研究結(jié)果顯示:大部分職業(yè)接觸苯和慢性苯中毒工人外周血中GATA-3表達(dá)水平上升伴T-bet表達(dá)水平下降趨勢(shì)。GATA-3表達(dá)上升其原因可能與苯代謝產(chǎn)物影響Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-6 生成增加相關(guān)[7]。另一方面，苯接觸或苯中毒后，由于T細(xì)胞異?；罨?，NF-κB的表達(dá)變化也可能參與了GATA-3調(diào)節(jié)表達(dá)。在NF-κB缺陷小鼠中，CD4+T細(xì)胞不能表達(dá)Th2細(xì)胞中的GATA-3，但可表達(dá)Th1細(xì)胞的T-bet和 IFN- γ[8，9]。此外也有研究表明 GATA-3 的表達(dá)上調(diào)是通過激活Ras/MAPK及calcineurin鈣依賴磷酸酶途徑所致，這兩個(gè)途徑的激活又依賴于轉(zhuǎn)錄因子c-Myb。

而GATA-3和T-bet是兩個(gè)相互調(diào)節(jié)、相互抑制的轉(zhuǎn)錄因子。T-bet基因表達(dá)下降的負(fù)調(diào)控途徑:(1)GATA-3及STAT-6可抑制T-bet的產(chǎn)生;(2)Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Jun B對(duì)T-bet也存在抑制作用;(3)此外在研究氧化還原失衡對(duì)免疫衰老作用的分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖激活受體 α(peroxisome proliferators-activated receptor alpha，PPARα)通過抑制p38絲裂酶原激酶活性抑制T-bet的轉(zhuǎn)錄[10]。而有研究證明苯的代謝產(chǎn)物確實(shí)可以改變細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)[11]。

大部分苯接觸及苯中毒工人中外周血T-bet/GATA-3比值均低于健康對(duì)照，表現(xiàn)為GATA-3高表達(dá)伴T-bet表達(dá)下降趨勢(shì)，這一變化也可以反映其Th1和Th2的變化情況，該變化特點(diǎn)與在腫瘤患者中所發(fā)現(xiàn)的Th1和Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)狀況相吻合[12]。腫瘤病人Th2細(xì)胞陽性率升高，Th1細(xì)胞陽性率降低，Th1/Th2陽性細(xì)胞比值降低，同時(shí)Th1型細(xì)胞因子降低，Th2型細(xì)胞因子升高，表現(xiàn)為Th2優(yōu)勢(shì)的漂移狀態(tài)。這其中的相關(guān)性有待進(jìn)一步的分析。

另一方面，小部分病人出現(xiàn)了完全相反的GATA-3/T-bet表達(dá)模式，提示機(jī)體中Th1/Th2的變化與大多數(shù)病人完全不同，這種不同的模式，與有關(guān)研究中所發(fā)現(xiàn)的再障病人中 T-bet和 GAT-3表達(dá)異常變化相同[13，14]，是否提示這部分病人與再障的發(fā)生存在一定的關(guān)聯(lián)性，有待進(jìn)一步對(duì)病人的資料進(jìn)行跟蹤分析。

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