張延平 張曉強(qiáng) 劉雅麗 黃瑋 孫玉蕊

1 中國人民解放軍第309醫(yī)院耳鼻喉科(北京 100091); 2 河南省醫(yī)學(xué)情報研究所; 3 河南省衛(wèi)生廳

GJB2基因編碼縫隙連接蛋白26(connxin 26,Cx26),該基因突變是導(dǎo)致非綜合征型聾(nonsyndromic sensorineural hearing impairment,NSHI)的主要原因。目前GJB2基因突變導(dǎo)致耳聾的機(jī)制還不完全清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是否參與了其致聾過程目前未見報道。GRP78/Bip即葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein,GRP78),又名免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(the immunoglobulin heavy chain binding protein,Bip),是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶,在ERS出現(xiàn)時其表達(dá)上調(diào),被認(rèn)為是ERS的特異性標(biāo)志物之一[1]。為了探討ERS與NSHI的發(fā)病是否有關(guān),本研究檢測了不同發(fā)育階段GJB2基因條件敲除小鼠耳蝸組織中GRP78/Bip表達(dá)水平,為進(jìn)一步研究NSHI的致病機(jī)理提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 GJB2基因條件敲除小鼠cCx26loxp/loxp;Pax2 Cre/+(cCx26)(實(shí)驗組,6只)由轉(zhuǎn)基因小鼠Cx26loxp/loxp與 Cx26loxp/-;Pax2 Cre/+小鼠(均由美國Emory大學(xué)林曦教授實(shí)驗室提供)雜交獲得,野生型BALB/c小鼠(6只)作為正常對照組。動物統(tǒng)一編號,統(tǒng)一喂養(yǎng),雙盲法測定,兩組分別選取P8、P12和P21三個發(fā)育階段各小鼠2只進(jìn)行實(shí)驗。

1.2 實(shí)驗方法 試劑分別為磷酸鹽緩沖液(PBS,Merk,德國)、多聚甲醛(Merk,德國)、T riton X-100(Sigma,美國)、羊抗鼠 GRP78多克隆抗體(Santa Cruz,美國)、羅丹明抗羊二抗(Jackson,美國)、含DAPI的封片劑(Invitrogen,美國)、解剖顯微鏡(Olympus,日本)、冰凍切片機(jī)(櫻花,日本)、激光共聚焦顯微鏡(LSM 510,Zeiss,Jena,德國)等。

1.2.1 耳蝸切片 動物戊巴比妥腹腔注射麻醉后,剪開胸骨,暴露心臟進(jìn)行心臟灌注,斷頭取耳蝸,在解剖顯微鏡下,用分離針把蝸尖挑開一小孔,挑破圓窗膜,取出鐙骨,用細(xì)玻璃吸管將4%多聚甲醛由蝸尖小孔灌注,使固定液經(jīng)前庭階、鼓階從前庭窗和圓窗流出,然后把標(biāo)本放入該固定液里4℃冰箱內(nèi)固定過夜。10%EDTA充分脫鈣,PBS緩沖液漂洗后,20%蔗糖溶液過夜,然后OCT過夜,定向包埋后,-20℃條件下7 μ m切片。

1.2.2 GRP78/Bip表達(dá)檢測 采用免疫組化方法檢測耳蝸組織中GRP78/Bip表達(dá)。耳蝸切片用含0.1%的Triton X-100的PBS(PBST)室溫漂洗30 min,加5%山羊血清室溫封閉 1 h,一抗(1：200稀釋)4℃染色過夜,PBST漂洗三次,每次10分鐘,加二抗(1：200稀釋)室溫1 h,PBST再次漂洗三次,封片,激光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 cCx26小鼠耳蝸形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 P8時cCx26小鼠耳蝸Corti器尚未發(fā)育成熟,內(nèi)外隧道均未形成,形態(tài)與對照組無明顯差異(圖1的a1、b1、c1);到P12時,對照組小鼠內(nèi)耳發(fā)育接近成熟,開始出現(xiàn)比較明顯的Corti器結(jié)構(gòu),而cCx26小鼠耳蝸Corti器仍為一團(tuán)細(xì)胞,未見明顯正常結(jié)構(gòu),血管紋、蓋膜、螺旋韌帶等結(jié)構(gòu)發(fā)育與對照組相比無明顯差異(圖2的a1、b1、c1)。P21時cCx26小鼠耳蝸與野生型相比出現(xiàn)較明顯的差異,cCx26小鼠在中回和底回Corti器缺失,僅余單層細(xì)胞,頂回Corti器尚存多層細(xì)胞,形成與P12類似的細(xì)胞團(tuán),未形成明顯的正常結(jié)構(gòu)(圖3的a1、b1、c1)。

2.2 GRP78/Bip的表達(dá) P8時GRP78/Bip在蓋膜、Crti器細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)明顯,而在耳蝸外側(cè)壁表達(dá)較弱,在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞未見明顯表達(dá)(圖1的a2、b2、c2)。P12時,GRP78/Bip上述陽性表達(dá)部位表達(dá)減弱,而且陽性部位也由P8時的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿(圖 2的 a2、b2、c2)。到 P21時,GRP78/Bip表達(dá)的位置與P8時相同,但表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng),在蓋膜、Corti器、耳蝸外側(cè)壁可見到明顯的表達(dá),而螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞仍未見明顯著色(圖3的a2 、b2 、c2)。

圖1 P8敲基因小鼠與野生型小鼠耳蝸Co rti器形態(tài)及GRP78/Bip表達(dá) a1、b1和c1為敲基因小鼠,a2、b2和c2為野生型小鼠

與野生型小鼠相比,GRP78/Bip在cCx26小鼠耳蝸的表達(dá)定位與野生型相同,但在P8和P12時cCx26表達(dá)更強(qiáng)(圖1、2中的 a1、b1、c1),到P21時,在蓋膜、耳蝸外側(cè)壁GRP78/Bip表達(dá)較野生型減弱,而在頂回僅存的不成熟 Corti細(xì)胞團(tuán)中,GRP78/Bip表達(dá)與野生型接近(圖3的a1、b1、c1)。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器,參與蛋白質(zhì)合成、折疊和寡聚化、脂類代謝、膽固醇代謝和鈣的儲存,其功能的實(shí)現(xiàn)依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中眾多的伴侶蛋白、較高的鈣離子濃度及其氧化環(huán)境的保持等。當(dāng)?shù)鞍滋腔种?、二硫鍵生成障礙、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、氧化狀態(tài)喪失、缺氧/缺血及某些藥物作用等造成未折疊或折疊異常蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量堆積時,均會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),細(xì)胞通過啟動未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR),降低蛋白合成速率,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān),上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白表達(dá)等機(jī)制,以恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài);但如果應(yīng)激刺激過于強(qiáng)烈、持久,內(nèi)環(huán)境紊亂無法糾正,則相應(yīng)凋亡機(jī)制被激活以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[2,3]。

正常小鼠出生時耳蝸發(fā)育尚未成熟,出生后繼續(xù)發(fā)育,大約在P9時Corti隧道、外隧道等結(jié)構(gòu)逐漸形成,到P14時發(fā)育完全成熟。而研究發(fā)現(xiàn)cCx26小鼠直到P30,其Corti隧道及 Neul's間隙還未形成,從P13開始出現(xiàn)耳蝸支持細(xì)胞凋亡,P16時耳蝸中回Corti器變?yōu)檎螌蛹?xì)胞,P30時中回Corti器單層細(xì)胞也開始消失,而直到P30耳蝸頂回的Corti器形態(tài)一直保持細(xì)胞聚集狀態(tài)[4],與本研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果還提示,GRP78/Bip在cCx26小鼠耳蝸的表達(dá)定位與野生型小鼠相同,但在P8和P12時cCx26小鼠的表達(dá)更強(qiáng),到P21時,在蓋膜、耳蝸外側(cè)壁GRP78/Bip表達(dá)較野生型小鼠減弱,而在頂回僅存的不成熟Corti細(xì)胞團(tuán)中GRP78/Bip表達(dá)與野生型接近,提示GRP78/Bip表達(dá)增高發(fā)生在小鼠出生后耳蝸發(fā)育成熟和聽覺成熟之前,發(fā)生在內(nèi)耳細(xì)胞缺失之前,提示ERS可能與GJB2突變導(dǎo)致的耳聾相關(guān)。

GJB2突變導(dǎo)致耳聾的原因還不完全清楚,目前公認(rèn)的學(xué)說主要有兩種：一是GJB2突變導(dǎo)致內(nèi)耳鉀離子循環(huán)受阻,在GJB2基因條件敲除小鼠耳蝸,由于缺乏Cx26,局部鉀離子顯著增加,導(dǎo)致位于內(nèi)耳支持細(xì)胞上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate transporter,GLAST)功能異常,造成谷氨酸的逆向轉(zhuǎn)運(yùn),使細(xì)胞外谷氨酸聚集,抑制了抗氧化物谷胱甘肽的合成,最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激[5];第二種學(xué)說是縫隙連接介導(dǎo)的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受阻,該學(xué)說提出內(nèi)耳感覺上皮是無血管器官,可能主要通過內(nèi)耳支持細(xì)胞之間形成的縫隙連接供給營養(yǎng)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,也就是說內(nèi)耳支持細(xì)胞傳輸葡萄糖,依賴于具有正常功能的縫隙連接,當(dāng)內(nèi)耳主要的縫隙連接蛋白Cx26和Cx30之一缺失時,支持細(xì)胞傳輸葡萄糖類似物(non-metabolizable D-glucose analogue,2-NBDG)顯著減少,提示在縫隙連接基因突變后,內(nèi)耳細(xì)胞可能處于缺乏能量狀態(tài)[6]。上述兩種學(xué)說最終都可能導(dǎo)致內(nèi)耳細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成障礙,導(dǎo)致異常多肽大量堆積內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,激活ERS以及后續(xù)的UPR導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致耳聾。研究發(fā)現(xiàn)體外構(gòu)建的中國人常見 GJB2突變表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后,突變蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,提示ERS及其相關(guān)凋亡通路可能與GJB2突變導(dǎo)致的耳聾相關(guān)[7]。本研究的結(jié)果可見在 P8和 P12時,cCx26小鼠耳蝸GRP78/Bip表達(dá)強(qiáng)于對照組小鼠,在聽覺功能成熟之前的P12這種差異更加明顯,提示在GJB2基因條件敲除小鼠出生后聽覺器官進(jìn)一步發(fā)育的過程中,由于缺乏縫隙連接,蛋白合成可能已經(jīng)受到影響,使ER內(nèi)堆積了大量錯誤折疊或未折疊蛋白,導(dǎo)致 ERS激活,GRP78/Bip表達(dá)增加。而在P8時內(nèi)耳細(xì)胞雖然形態(tài)尚未出現(xiàn)變化,但是潛在的變化已經(jīng)開始,這一情況到了聽覺發(fā)育成熟前夕的P12更加顯著,機(jī)體通過一系列的信號反饋機(jī)制使分子伴侶合成增加試圖扭轉(zhuǎn)這一局面,但在聽覺發(fā)育開始時發(fā)生的一系列變化使已經(jīng)存在的ERS更加激烈和持久,機(jī)體無法挽回內(nèi)環(huán)境的失調(diào),終于激活了相關(guān)細(xì)胞凋亡通路,導(dǎo)致內(nèi)耳細(xì)胞的缺失,致動物耳聾。因此ERS可能參與了GJB2基因突變導(dǎo)致的非綜合征型聾的發(fā)生過程,但ERS相關(guān)信號分子在cCx26小鼠耳聾發(fā)病中的具體作用還需要進(jìn)一步的研究。

(致謝：本實(shí)驗在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家飼料工程技術(shù)研究中心完成,在此向給與本研究幫助的李德發(fā)教授、尹靖東教授、董冰教授和馬紅老師致以衷心的感謝!)

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