林云成，武 瑞，王躍強(qiáng)，吳國(guó)軍，郭婷婷，韓 旭

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

近年來(lái)，畜禽免疫抑制性疾病給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大危害，因此，人們?cè)絹?lái)越重視通過(guò)應(yīng)用免疫增強(qiáng)劑來(lái)提高畜禽機(jī)體抗病力。免疫增強(qiáng)劑主要分為化學(xué)合成小分子、微生物制劑、生物制劑和中草藥等［1］。其中，中草藥因具有資源豐富、價(jià)格低廉、毒副作用小、作用廣泛等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞［2］。中藥免疫增強(qiáng)劑的研究與開(kāi)發(fā)具有廣闊的應(yīng)用前景，但其作用機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)旨在通過(guò)檢測(cè)昆明系小鼠免疫指標(biāo)，探討歸芪甘草湯的作用途徑和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 6周齡昆明系小鼠120只，體重18～22g，雌雄各半，成年豚鼠3只，均購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所。公雞1只，市售。

1.2 試驗(yàn)材料 歸芪甘草湯（由黃芪、當(dāng)歸、炙甘草、熟地和黨參組成，通過(guò)傳統(tǒng)水煎法獲得復(fù)方藥液，濃縮為含生藥量1g／mL）；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺（Cy，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：10011121）為3mg／mL的注射液；CD4／CD8熒光抗體（購(gòu)于Miltenyi Biotec公司）；Alsever＇s溶液；雞紅細(xì)胞懸液和補(bǔ)體制備［3］。

1.3 試驗(yàn)主要儀器 XSP-18S光學(xué)顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）；Z36HK高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hermle公司）；Aira分選式流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；V-5100可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與內(nèi)容 選擇6周齡昆明系小鼠120只，預(yù)飼2d后，隨機(jī)分為4組（即對(duì)照Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅰ組、對(duì)照Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅱ組），每組30只小鼠，雌雄各半。分別進(jìn)行健康動(dòng)物復(fù)方中藥應(yīng)用試驗(yàn)（試驗(yàn)Ⅰ組小鼠每日每只灌服0.5mL復(fù)方中藥，對(duì)照Ⅰ組小鼠每日每只灌服等量蒸餾水）和免疫抑制動(dòng)物復(fù)方中藥應(yīng)用試驗(yàn)（對(duì)照Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅱ組小鼠，在試驗(yàn)第3、5、7、9天均腹腔注射濃度為3mg／mL的免疫抑制劑0.5mL，復(fù)制小鼠免疫抑制模型；在復(fù)制模型的同時(shí)，試驗(yàn)Ⅱ組小鼠每日每只灌服0.5mL復(fù)方中藥，對(duì)照Ⅱ組小鼠灌服等量蒸餾水）。

1.4.1 小鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD4+和CD8+的檢測(cè) 在試驗(yàn)第15天，每組取10只小鼠放血處死取脾臟。用紅細(xì)胞裂解液（ACK）反復(fù)裂解脾臟內(nèi)紅細(xì)胞，當(dāng)脾臟T淋巴細(xì)胞容積恒定后，用PBS洗除ACK，并將T淋巴細(xì)胞稀釋為2×106cells／mL細(xì)胞懸液。取500μL細(xì)胞懸液，同時(shí)加入CD4+、CD8+熒光抗體各8μL，4℃避光孵育30min后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2 小鼠B淋巴細(xì)胞IgM的檢測(cè) 在試驗(yàn)第8天，每組取10只小鼠腹腔注射5%生理鹽水雞血紅細(xì)胞懸液0.2mL進(jìn)行免疫，做好標(biāo)記，專(zhuān)用于IgM的檢測(cè)。在試驗(yàn)第15天，小鼠眼球框靜脈插管取血，應(yīng)用比色法測(cè)定光密度［3］。

1.4.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的檢測(cè) 在試驗(yàn)第15天灌服復(fù)方中藥4h后，每組取10只小鼠腹腔注射3%雞血紅細(xì)胞懸液0.5mL，2h后脫頸處死小鼠，腹腔注入生理鹽水2mL，輕揉小鼠腹部，吸取腹腔沖洗液，滴片，自然晾干后用瑞氏染色，顯微鏡觀察，計(jì)算巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)［3］。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示試驗(yàn)結(jié)果，采用LSD進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 歸芪甘草湯對(duì)小鼠CD4+和CD8+的影響 見(jiàn)表1。

表1 歸芪甘草湯對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞表面分子CD4＋%、CD8＋%及CD4＋／CD8＋的影響（n=10）

表1 歸芪甘草湯對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞表面分子CD4＋%、CD8＋%及CD4＋／CD8＋的影響（n=10）

注：不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05）；不同的大寫(xiě)字母表示差異極顯著（P＜0.01）。下表同

2.2 歸芪甘草湯對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞IgM的影響 見(jiàn)表2。

表2 歸芪甘草湯對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞IgM的影響（n=10，）

表2 歸芪甘草湯對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞IgM的影響（n=10，）

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2.3 歸芪甘草湯對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響 見(jiàn)表3。

表3 歸芪甘草湯對(duì)試驗(yàn)小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響（n=10，）

表3 歸芪甘草湯對(duì)試驗(yàn)小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響（n=10，）

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3 分析與討論

T淋巴細(xì)胞在機(jī)體特異性細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要的作用。CD4和CD8是T淋巴細(xì)胞表面重要亞群，它們會(huì)在成熟T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)CD4+（TH細(xì)胞）和CD8+（TC細(xì)胞）；TH細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以促進(jìn)T、B細(xì)胞免疫應(yīng)答，TC細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子具有免疫抑制和細(xì)胞毒性作用［4］；當(dāng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能正常時(shí)，CD4+／CD8+處于恒定范圍；因此，可以通過(guò)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞表面亞群CD4+／CD8+來(lái)了解機(jī)體細(xì)胞免疫功能。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)健康小鼠，灌服復(fù)方中藥和灌服蒸餾水的小鼠CD4+／CD8+差異不顯著（P＞0.05），這說(shuō)明健康小鼠CD4+／CD8+處于動(dòng)態(tài)平衡；對(duì)免疫抑制小鼠，灌服復(fù)方中藥和灌服蒸餾水的小鼠CD4+／CD8+差異極顯著（P＜0.01），這說(shuō)明復(fù)方中藥可以有效增強(qiáng)免疫功能受損小鼠的細(xì)胞免疫功能。

溶血素（IgM）是B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生最早的免疫球蛋白分子，也是在B淋巴細(xì)胞表面表達(dá)最早的抗體，在人工免疫或病原體感染后，它將最早產(chǎn)生，因此血清中IgM含量檢測(cè)可作為評(píng)價(jià)體液免疫功能之一［5］。試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是健康小鼠還是免疫抑制小鼠，灌服復(fù)方中藥后，其OD值均高于灌服蒸餾水小鼠，這說(shuō)明復(fù)方中藥具有提高小鼠IgM含量，增強(qiáng)小鼠體液免疫功能的作用。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分，具有吞噬、殺傷、抗原遞呈、分泌生物活性物質(zhì)、調(diào)控局部組織微環(huán)境以及抑制腫瘤等多種免疫功能。試驗(yàn)結(jié)果表明，灌服中藥的健康小鼠和免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞功能均比灌服蒸餾水小鼠強(qiáng)，這說(shuō)明復(fù)方中藥可以增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，本復(fù)方中藥提取液可以增強(qiáng)昆明系小鼠的免疫功能，尤其是對(duì)免疫抑制小鼠的免疫功能增強(qiáng)更為明顯。因此，研究開(kāi)發(fā)動(dòng)物專(zhuān)用的中藥免疫增強(qiáng)劑具有實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。

［1］段若竹，吳劍波.免疫增強(qiáng)劑的研究應(yīng)用及展望［J］.國(guó)外醫(yī)藥：抗生素分冊(cè)，2006，27（2）：54-57.

［2］曹禮華，劉家國(guó).中藥對(duì)機(jī)體免疫功能影響研究進(jìn)展［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2008，（3）：28-30.

［3］謝仲權(quán)，牛樹(shù)琦，劉鳳華.天然中草藥飼料添加劑研究方法［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，2001：87-88.

［4］韓愛(ài)云.熱應(yīng)激對(duì)肉雞淋巴細(xì)胞鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響及鉻的調(diào)控作用［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010：18.

［5］崔治中，崔保安.獸醫(yī)免疫學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004：44.