鄺輝 曹蘋 王曉煒 深圳市藥品檢驗(yàn)所 (深圳 518057)

鹵化丁基橡膠塞因其具有優(yōu)良的化學(xué)惰性以及氣密性而廣泛用于藥品包裝。鹵化丁基橡膠塞與內(nèi)裝藥物的相容性自始就是各生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)，同時(shí)其生物安全性也逐漸引起人們的注意。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)是生物安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分，是評(píng)價(jià)直接或間接接觸人體組織和細(xì)胞的醫(yī)療器械和藥品包裝材料的通用方法[1]。目前我國(guó)藥品包裝材料相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)推薦的方法有：相對(duì)增殖度法、瓊脂擴(kuò)散法、直接接觸法、浸提法[2]。浸提液實(shí)驗(yàn)是目前用于檢測(cè)藥品包裝材料細(xì)胞毒性的比較廣泛的一種方法，選擇不同的浸提方法可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著直接的影響。本實(shí)驗(yàn)遵循藥品包裝材料的生物學(xué)評(píng)價(jià)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)不同的浸提方法制備相應(yīng)的浸提液，以MTT 比色法[3]作為主要檢測(cè)手段評(píng)價(jià)鹵化丁基橡膠塞浸提液對(duì)細(xì)胞的毒性，重點(diǎn)考察不同的浸提方法對(duì)各企業(yè)生產(chǎn)的鹵化丁基橡膠塞細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

小鼠成纖維細(xì)胞L929(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma)，倒置相差顯微鏡(Lecia)，Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀(Labsystems)，Milli-Q純水系統(tǒng)，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(Binder)，針式過濾器(Pall)，胎牛血清(Gibco)，MEM培養(yǎng)液(Sigma)，胰蛋白酶(Gibco)，噻唑藍(lán)(MTT，Sigma)，DMSO(Amresco)，11批藥用鹵化丁基橡膠塞，高密度聚乙烯(北京第一制藥廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 浸提液的制備

浸提方法一[2]：將供試品用肥皂水清洗除去油污，再用純化水沖洗干凈，濾紙吸干后切成0.5cm×2.0cm條狀，放入玻璃器皿內(nèi)，121?C高壓蒸汽滅菌30min。滅菌后在無菌操作下按0.2g/mL比例加浸提液進(jìn)行浸提24h。

浸提方法二[1]：將供試品用肥皂水清洗除去油污，再用純化水沖洗干凈，121?C高壓蒸汽滅菌30min。滅菌后在無菌操作下按0.2g/mL比例加浸提液進(jìn)行浸提24h。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組

依據(jù)上述的浸提方式分為：A液，將供試品剪成條狀進(jìn)行浸提；B液，保持供試品完整狀態(tài)進(jìn)行浸提。浸提介質(zhì)均為10%胎牛血清的MEM；每組均設(shè)實(shí)驗(yàn)組(鹵化丁基橡膠塞)A液，每組均設(shè)實(shí)驗(yàn)組(鹵化丁基橡膠塞)B液，陰性對(duì)照(高密度聚乙烯)，陽性對(duì)照(含5%DMSO 的相應(yīng)浸提介質(zhì))和空白對(duì)照，各組設(shè)6平行孔。

1.2.3 L929細(xì)胞懸液制備

取傳代數(shù)次，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的L929成纖維細(xì)胞，待0.25%胰酶消化后，加入10%胎牛血清的MEM中止消化，用吸管把細(xì)胞從瓶壁上吹打下來，制備成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml備用。

1.2.4 MTT 比色法

將已制備的細(xì)胞懸液(1×104/ml)接種于96 孔培養(yǎng)板中，置5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37?C培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，各組中實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組分別加入相應(yīng)浸提液，陽性對(duì)照組加入含5%DMSO MEM。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h后，鏡下觀察其形態(tài)。隨后每孔加入20ul的MTT 溶液(5mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去原液，加入150ul DMSO,振蕩10min，在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度(OD)。

1.2.5 觀察與檢測(cè)指標(biāo)

根據(jù)以下公式計(jì)算其他實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的相對(duì)增殖率(RGR)， 空白對(duì)照組細(xì)胞增殖活性為100%。

細(xì)胞相對(duì)增殖率與細(xì)胞毒性分級(jí)的關(guān)系見表1[4]：

表1 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS11.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以 表示，兩組數(shù)據(jù)的比較選擇Student-t檢驗(yàn)。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

加樣后24、48、72h鏡下觀察孔內(nèi)細(xì)胞，可見各處理組中的空白組和陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)條梭形或不規(guī)則多邊形，細(xì)胞貼壁良好，無空泡，胞漿內(nèi)可見離散顆粒，細(xì)胞數(shù)量增加正常。陽性對(duì)照組細(xì)胞多數(shù)呈圓形，胞核固縮或崩解，無折光性，數(shù)量無明顯增加。

表2 各組加樣后72h的OD 值(n＝6)

MTT比色法測(cè)定于加樣后72h的OD值見表2。陽性對(duì)照與空白對(duì)照的OD值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，陰性對(duì)照與空白對(duì)照的OD值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明本實(shí)驗(yàn)體系適用于該試驗(yàn)樣品細(xì)胞毒性的判定。

在共計(jì)11批次的鹵化丁基橡膠塞體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，兩組來自同一家生產(chǎn)企業(yè)同一型號(hào)不同生產(chǎn)批次的鹵化丁基橡膠塞A液和B液無顯著性差異(P＞0.05)，其他各組A液和B液之間OD值均有顯著性差異(P < 0.05)，說明不同的浸提方法對(duì)于體外細(xì)胞毒性MTT法結(jié)果有著直接的影響。

3 討論

目前鹵化丁基橡膠塞廣泛地用于藥品包裝材料，為保證其使用的安全性，選擇合適的方法進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)是必要的步驟。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)是目前國(guó)內(nèi)外生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中重要的一環(huán)，國(guó)家藥品包裝容器(材料)方法標(biāo)準(zhǔn)中有推薦的體外細(xì)胞毒性的方法，本文作者選擇GB/T 14233.2-2005推薦的MTT比色法來評(píng)價(jià)，因其作為有效檢測(cè)細(xì)胞線粒體損傷的快速方法，具有與細(xì)胞增殖相關(guān)性好，對(duì)樣品的適應(yīng)性強(qiáng)，觀測(cè)指標(biāo)客觀等優(yōu)勢(shì)，因而廣泛用于多聚物的細(xì)胞毒性初篩[4]。

浸提是一個(gè)復(fù)雜的過程，受時(shí)間、溫度、表面積與體積比、浸提介質(zhì)以及材料的相平衡的影響[5]。在藥包材的生物學(xué)評(píng)價(jià)的具體實(shí)踐中，浸提方式的選擇對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)果的影響程度以及評(píng)價(jià)結(jié)果是否存在差異等問題目前還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為探索上述因素對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)選用了表面積與體積比的不同即是否將測(cè)試樣品剪成小條作為考察對(duì)象，同時(shí)固定影響浸提的其他條件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，不同的浸提方法對(duì)于鹵化丁基橡膠塞可溶出物質(zhì)的種類和數(shù)量有著決定的影響。根據(jù)表2結(jié)果分析，我們可以知道，通過不同的浸提方法制備的浸提液，11批中的9批樣品體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。分析造成這一結(jié)果的原因： 1)切割膠塞后，按YBB00012003制備浸提液，使得細(xì)胞毒性O(shè)D值普遍下降，原因可能有a.切割后非暴露面暴露，浸提表面積增加；b.原有膠塞失去完整的外形，這兩個(gè)原因都可能導(dǎo)致樣品可溶出有毒物質(zhì)加快增多。2)切割鹵化丁基橡膠塞后，也有兩批次的膠塞的結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異，說明不同生產(chǎn)企業(yè)的鹵化丁基橡膠塞產(chǎn)品在體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)上還是有差異，可能是其生產(chǎn)工藝中各種添加劑或其他化學(xué)物質(zhì)使然。我們認(rèn)為：破壞原有樣品的正常形態(tài)即改變表面積與體積比，對(duì)于評(píng)價(jià)鹵化丁基橡膠塞的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)是有影響的。

[1]GB/T 16886.5-2003 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分:體外細(xì)胞毒性試驗(yàn).

[2]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品包裝容器(材料)方法標(biāo)準(zhǔn)(試行)YBB00012003細(xì)胞毒性檢查法.

[3]GB/T 14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法》.

[4]Sgouras, D, Duncan, R.Methods for evaluation of biocompatibility of soluble synthetic polymers which have potential for medical use.1.Use of the tetrazoliumbased colorimetric assay (MTT) as a preliminary screen for evaluation of in vitro cytotoxicity.Mater.Med,1990,1(61-68).

[5]GB/T 16886.12-2005醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第12部分：樣品制備與參照樣品.