魏二虹 張文舉 劉東軍 于 磊 石國慶

棉籽餅粕富含蛋白質(zhì)，是很好的動(dòng)物飼料蛋白資源。但因其含有對(duì)動(dòng)物有毒的游離棉酚，使其利用價(jià)值受到極大限制。為此，國內(nèi)外有關(guān)研究人員對(duì)棉籽餅粕的脫毒方法及途徑進(jìn)行了廣泛而深入的研究，取得了許多研究成果，如物理法、化學(xué)法[1-5]以及微生物發(fā)酵法等。微生物發(fā)酵法是20世紀(jì)80年代后期在中國首先發(fā)展起來的一種棉籽餅粕脫毒途徑。該方法是將特定微生物接種到棉籽餅粕培養(yǎng)基中，在一定的條件下，利用微生物在飼料原料中的生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝，棉酚被分解利用或與蛋白質(zhì)氨基酸結(jié)合形成結(jié)合棉酚，從而達(dá)到脫毒的目的[6-12]。前人對(duì)微生物固體發(fā)酵棉籽餅粕脫毒的研究主要集中在脫毒菌種的優(yōu)化篩選[6-7,12-15]、發(fā)酵底物組成及發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化[8-11]、發(fā)酵前后棉籽餅粕養(yǎng)分含量及消化利用率的變化[16-19]等方面，但對(duì)棉籽餅粕微生物固態(tài)發(fā)酵脫毒的詳細(xì)機(jī)理的研究卻很少[20]。本研究主要利用浙江大學(xué)選育的對(duì)棉酚具有較強(qiáng)降解力的熱帶假絲酵母菌ZD-3(Candida tropicalis)、釀酒酵母菌ZD-5(Saccharomyces cerevisiae)和黑曲霉ZD-8(Aspergillus niger)對(duì)棉籽餅進(jìn)行復(fù)合菌種發(fā)酵，然后通過測(cè)定發(fā)酵底物中總棉酚（Total Gossypol，TG)、游離棉酚(Free Gossypol，F(xiàn)G)、結(jié)合棉酚(Bound Gossypol，BG)含量的變化，來研究復(fù)合發(fā)酵對(duì)棉籽餅混合底物中棉酚含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)底物

棉籽餅由新疆石河子產(chǎn)，粉碎，過60目篩。經(jīng)測(cè)定可知樣品中TG含量7 062.7mg/kg，F(xiàn)G含量921.7mg/kg、BG含量6 141.0mg/kg，粗蛋白含量39.20%。

棉籽餅混合底物：將上述棉籽餅與玉米粉、麥麩按7：2：1的比例混合均勻成基礎(chǔ)底物，復(fù)合發(fā)酵時(shí)再按基礎(chǔ)底物與蒸餾水1：0.9的比例加入蒸餾水，在0.056 MPa條件下，112.6℃蒸汽滅菌20 min。

1.1.2 菌種和培養(yǎng)基

1.1.2.1 菌種

熱帶假絲酵母菌ZD-3由浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所選育提供；釀酒酵母菌ZD-5、黑曲霉ZD-8由石河子大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)教研組保藏。

1.1.2.2 麥芽汁培養(yǎng)基

大麥芽100 g粉碎，放入1 000 ml大燒杯中，加蒸餾水 400～500 ml，至烘箱中 60 ℃恒溫 4～5 h，然后用8層紗布過濾，濾液一般較混濁。將一枚蛋清量加蒸餾水20 ml，攪拌至有大量泡沫，倒入混濁濾液中，煮沸，維持5 min，用8層紗布過濾，得澄清麥芽汁，用手持糖量折光儀測(cè)定糖度，然后稀釋到5oBé，分裝于幾個(gè)三角瓶中，每個(gè)三角瓶20 ml，112.6℃滅菌30 min，保存于4℃冰箱中備用。

1.1.2.3 麥芽汁斜面培養(yǎng)基

5oBé麥芽汁，加入瓊脂2.0%，在0.056 MPa條件下，112.6℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 滅菌組的制備

復(fù)合發(fā)酵時(shí)按基礎(chǔ)底物與蒸餾水1：0.9的比例加入蒸餾水，在0.056MPa條件下，112.6℃蒸汽滅菌20min。

1.2.2 菌種制備

1.2.2.1 ZD-3液體菌種

將選育的熱帶假絲酵母接入麥芽汁斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72 h，挑取一環(huán)菌苔接入5 ml麥芽汁中，在試管中30℃、150 r/min搖動(dòng)培養(yǎng)24 h（一級(jí)菌種），取1.0 ml一級(jí)菌種接入20 ml麥芽汁，在100 ml三角瓶中30℃、150 r/min搖動(dòng)培養(yǎng)20 h（二級(jí)菌種）。

1.2.2.2 ZD-3固體菌種

取5 ml ZD-3二級(jí)菌種接入上述100 g棉籽餅粕底物中，在500 ml三角瓶中30℃恒溫靜止培養(yǎng)48 h，然后將培養(yǎng)物放入烘箱，60℃烘干48 h，粉碎，放入密封袋中，存放于4℃冰箱中備用。

1.2.2.3 ZD-5液體、固體菌種

制備方法同ZD-3。

1.2.2.4 ZD-8固體菌種

稱取棉籽餅粕底物100 g放入500 ml三角瓶中，加入70 ml蒸餾水，攪拌均勻，0.056 MPa、112.6℃蒸汽滅菌20 min。底物冷卻后稱取1 g黑曲霉菌種接入經(jīng)高壓滅菌過的100 g棉籽餅粕底物中，在500 ml三角瓶中30℃恒溫靜止培養(yǎng)24 h，觀察三角瓶中是否泛白，如果泛白證明有黑曲霉菌生長(zhǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)好的黑曲霉固體菌種放入烘箱中，40℃烘干24 h，粉碎，放入密封袋中，存放于4℃冰箱中備用。

1.2.3 復(fù)合菌種發(fā)酵

1.2.3.1 ZD-3與ZD-5二級(jí)菌種復(fù)合固體發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

ZD-3和ZD-5二級(jí)菌種添加的總量為5 ml，二級(jí)菌種添加比例為 3： 2、3： 1、2： 1、1： 1、1： 2、1： 3、2：3，即上述兩種二級(jí)菌種的添加量分別為3 ml和2 ml；3.75 ml和 1.25 ml；3.33 ml和 1.67 ml；2.5 ml和2.5 ml；1.67 ml和 3.33 ml；1.25 ml和 3.75 ml；2 ml和3 ml。試驗(yàn)菌種按上述各比例接入到高壓滅菌過的100 g棉籽餅混合底物中，混合均勻，在500 ml三角瓶中30℃恒溫靜止培養(yǎng)48 h，設(shè)3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵棉籽餅混合底物及未發(fā)酵底物(對(duì)照)放入烘箱中，60℃烘干48 h，粉碎，過60目篩制樣。

1.2.3.2 ZD-3與ZD-8固體菌種復(fù)合固體發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

ZD-3與ZD-8固體菌種添加總量為1 g，添加比例為 3： 2、3： 1、2： 1、1： 1、1： 2、1： 3、2： 3，即上述兩種二級(jí)菌種的添加量分別為0.60 g和0.40 g；0.75 g和 0.25 g；0.67 g 和 0.33 g；0.50 g 和 0.50 g；0.33 g 和0.67 g；0.25 g和 0.75 g；0.40 g和 0.60 g。試驗(yàn)菌種按上述各比例接入到高壓滅菌過的100 g棉籽餅混合底物中，混合均勻，在500 ml三角瓶中30℃恒溫靜止培養(yǎng)48 h，設(shè)3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵棉籽餅混合底物及未發(fā)酵底物(對(duì)照)放入烘箱中，60℃烘干48 h，粉碎，過60目篩制樣。

1.3 試驗(yàn)測(cè)定指標(biāo)

測(cè)定棉籽餅混合底物發(fā)酵前后TG、FG、BG含量。其中 TG采用 ISO6866—1985方法測(cè)定、FG采用GB13086—1991方法測(cè)定、BG按照公式BG=TG－FG計(jì)算得出。因?yàn)榘l(fā)酵產(chǎn)物比發(fā)酵前重量減少，為了使數(shù)據(jù)表示更準(zhǔn)確，所以發(fā)酵后產(chǎn)物總棉酚、游離棉酚和結(jié)合棉酚含量采用校正含量表示，單位是mg/kg。

發(fā)酵后底物中TG(FG、BG)校正含量(mg/kg)=發(fā)酵后底物TG(FG、BG)單位含量×回收率；

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及多重比較（LSD），所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZD-3與ZD-5復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物回收率的變化(見表1)

表1 不同比例的ZD-3和ZD-5發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵前后的重量及其回收率（風(fēng)干物質(zhì)計(jì)）

由表1可知，添加不同比例的熱帶假絲酵母、釀酒酵母復(fù)合菌種發(fā)酵棉籽餅混合底物后，除ZD-3與ZD-5之比為2：3組外，各發(fā)酵組之間回收率差異極顯著(P＜0.01)，回收率在 82.36%～83.33%之間。ZD-3：ZD-5之比為1：3時(shí)棉籽餅混合底物發(fā)酵產(chǎn)物回收率較高為83.33%，ZD-3：ZD-5之比為3：2時(shí)棉籽餅混合底物發(fā)酵產(chǎn)物回收率較低為82.36%，兩者之間回收率相差0.97個(gè)百分點(diǎn)(P＜0.01)。

2.2 熱帶假絲酵母與釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物中的TG、FG、BG含量的變化(見表2)

由表2可以看出，添加不同比例的熱帶假絲酵母、釀酒酵母復(fù)合菌種發(fā)酵棉籽餅混合底物，各發(fā)酵組與對(duì)照組相比TG、FG、BG含量均極顯著降低（P＜0.01），都具有很好的脫毒效果，脫毒率在84.71%～90.82%。各發(fā)酵組與滅菌組相比，TG、FG、BG含量均極顯著降低（P＜0.01），均具有很好的脫毒效果，脫毒率在65.82%～90.82%。當(dāng)ZD-3：ZD-5為3：1時(shí)，脫毒效果最好，此時(shí)FG的含量?jī)H為58.94mg/kg，脫毒率高達(dá)90.82%，同滅菌組相比脫毒率增加了25個(gè)百分點(diǎn)。

由以上分析可以得出：不同比例的熱帶假絲酵母、釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵棉籽餅混合底物，均可使發(fā)酵產(chǎn)物中的 TG、FG、BG 含量極顯著降低（P＜0.01），說明混合底物發(fā)酵時(shí)FG被降解消除，而不是轉(zhuǎn)變成BG，從而達(dá)到脫毒的目的。

表2 熱帶假絲酵母與釀酒酵母復(fù)合發(fā)酵對(duì)棉籽餅底物中棉酚含量的影響(以風(fēng)干物質(zhì)計(jì))

2.3 ZD-3與ZD-8復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物回收率的變化(見表3)

由表3可以看出，不同比例的熱帶假絲酵母、黑曲霉復(fù)合菌種發(fā)酵棉籽餅混合底物，除ZD-3與ZD-8之比為2：1組外，各發(fā)酵組之間回收率差異極顯著(P＜0.01)，回收率在 80.79%～82.73%之間。ZD-3：ZD-8之比為1：1時(shí)棉籽餅混合底物發(fā)酵產(chǎn)物回收率較高為82.73%，ZD-3：ZD-8之比為1：3時(shí)棉籽餅混合底物發(fā)酵產(chǎn)物回收率較低為80.79%，兩者之間回收率相差1.94個(gè)百分點(diǎn)(P＜0.01)。

2.4 熱帶假絲酵母與黑曲霉復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物中的TG、FG、BG含量的變化(見表4)

表3 不同比例的ZD-3和ZD-8發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵前后的重量及其回收率（風(fēng)干物質(zhì)計(jì)）

由表4可以看出，添加不同比例的熱帶假絲酵母、黑曲霉復(fù)合菌種發(fā)酵棉籽餅混合底物,與對(duì)照組相比 TG、FG、BG 含量均極顯著降低（P＜0.01），各發(fā)酵組都具有很好的脫毒效果，脫毒率在68.39%～79.61%。各發(fā)酵組與滅菌對(duì)照組B相比，TG、FG、BG含量均極顯著降低（P＜0.01），都具有很好的脫毒效果，脫毒率在65.82%～79.61%。當(dāng)ZD-3：ZD-8為1：3時(shí)，脫毒效果最好，此時(shí)FG的含量?jī)H為130.94mg/kg，脫毒率達(dá)79.61%，同滅菌組相比脫毒率增加了13.79個(gè)百分點(diǎn)。

表4 熱帶假絲酵母菌與黑曲霉發(fā)酵對(duì)棉籽粕底物中棉酚含量的影響(以風(fēng)干物質(zhì)計(jì))

由以上分析可以得出：不同比例的熱帶假絲酵母、黑曲霉復(fù)合發(fā)酵棉籽餅混合底物，均可使產(chǎn)物中的 TG、FG、BG 含量極顯著降低（P＜0.01），說明棉籽餅混合底物發(fā)酵時(shí)FG被降解消除，而不是轉(zhuǎn)變成BG，從而達(dá)到脫毒的目的。

3 討論

微生物固體發(fā)酵可顯著降低游離棉酚含量已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，但游離棉酚是被降解消除，還是形成結(jié)合棉酚未見報(bào)道，總棉酚和結(jié)合棉酚的變化規(guī)律未見闡明。本研究發(fā)現(xiàn)：棉籽餅混合底物經(jīng)過熱帶假絲酵母與釀酒酵母或與黑曲霉以不同比例菌種復(fù)合發(fā)酵后，均可極顯著降低發(fā)酵產(chǎn)物游離棉酚和結(jié)合棉酚含量(P＜0.01)，各處理組都具有很好的脫毒效果，而與混合底物滅菌對(duì)照組相比，脫毒率都有所提高。結(jié)論表明，棉籽餅及其混合底物經(jīng)復(fù)合菌種發(fā)酵后，游離棉酚和結(jié)合棉酚含量均極顯著降低(P＜0.01)，通過發(fā)酵處理，可消除游離棉酚對(duì)動(dòng)物的毒害作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的復(fù)合發(fā)酵效果優(yōu)于熱帶假絲酵母與黑曲霉的發(fā)酵效果，菌種比例對(duì)發(fā)酵結(jié)果有顯著影響。

4 結(jié)論

①熱帶假絲酵母與釀酒酵母或與黑曲霉對(duì)棉籽餅混合底物進(jìn)行二元復(fù)合發(fā)酵，均可極顯著降低底物中TG、FG和BG含量，F(xiàn)G和BG的減少部分均被降解消除。

②添加熱帶假絲酵母與釀酒酵母的復(fù)合發(fā)酵效果優(yōu)于添加熱帶假絲酵母與黑曲霉的發(fā)酵效果，并且菌種比例對(duì)發(fā)酵結(jié)果有顯著影響。當(dāng)熱帶假絲酵母與釀酒酵母的比例為3：1時(shí)，脫毒效果最好，脫毒率可達(dá)90.82%。

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