DNA高甲基化與腫瘤的研究進(jìn)展

李燦美 綜述 楊 凌，曾 云 審校

（昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 血液科，云南 昆明 650032）

在哺乳動(dòng)物DNA分子中，DNA甲基化是指甲基（-CH3）在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs） 催化下，共價(jià)結(jié)合到DNA分子的胞嘧啶（C）堿基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）的表觀遺傳學(xué)修飾過(guò)程。DNA甲基化發(fā)生在DNA復(fù)制完成之后，因此不改變DNA序列，是一種可逆的變化[1]，是通過(guò)影響基因的表達(dá)以改變其功能。DNA異常甲基化分為DNA高甲基化和DNA低甲基化。研究證實(shí)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中DNA高甲基化比低甲基化更為常見。DNA高甲基化是癌變過(guò)程中早期的分子異常之一,也是早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的潛在生物學(xué)標(biāo)志，其對(duì)腫瘤患者的早期檢測(cè)、治療和預(yù)后等都有重要意義。因此，本文將對(duì)DNA高甲基化與腫瘤的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、DNA高甲基化產(chǎn)生的原因

導(dǎo)致腫瘤高甲基化模式改變的機(jī)制尚不清楚，其可能和以下因素有關(guān)：⑴保護(hù)胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤島（CpG島）免受甲基化因子的丟失。在正常細(xì)胞中，多數(shù)基因啟動(dòng)子區(qū)通常處于非甲基化狀態(tài)，這可能和一些保護(hù)性因子如反式作用因子等的存在有關(guān)。Butcher等[2]報(bào)道：反式作用因子與CpG島起始點(diǎn)的Sp1位點(diǎn)結(jié)合可防止乳腺癌易這個(gè)結(jié)果提示某些反式作用因子可保護(hù)CpG島免于甲基化。因此，在感基因（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1） 啟動(dòng)子甲基化，缺乏CpG島保護(hù)因子的情況下將導(dǎo)致甲基化狀態(tài)的出現(xiàn)。⑵腫瘤中DNMTs的過(guò)度表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)DNMTs,尤其是DNMT1在腫瘤組織中表達(dá)水平升高,這提示DNMTs與腫瘤中的甲基化異常有關(guān),并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。⑶DNMTs復(fù)合物受到破壞，即指DNMTs酶的抑制成分的調(diào)節(jié)失控，該失控可能與DNMTs形成復(fù)合物的一種或幾種因子如：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb），DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1相關(guān)蛋白-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合蛋白（DMAP1-DNMT結(jié)合蛋白）的丟失所致。⑷基因組各部分復(fù)制時(shí)序性的破壞。基因組的復(fù)制在細(xì)胞周期S期通過(guò)空間和短暫模式得以實(shí)現(xiàn)。在此過(guò)程中的變化使復(fù)制區(qū)域和染色質(zhì)構(gòu)成的區(qū)域無(wú)法正常地相互作用。CpG島可能通過(guò)復(fù)制時(shí)序紊亂發(fā)生異常甲基化。

二、DNA高甲基化導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的機(jī)制

在正常狀態(tài)下基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島一般是非甲基化的，當(dāng)其發(fā)生高甲基化時(shí)，常導(dǎo)致抑癌基因、DNA修復(fù)基因等轉(zhuǎn)錄沉默，使之功能喪失，從而導(dǎo)致正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化調(diào)控失常以及DNA損傷不能被及時(shí)修復(fù)，這與多種腫瘤形成密切相關(guān)。

1.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因高甲基化：蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1） 是造血細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本負(fù)調(diào)控因子，90%的成人T淋巴細(xì)胞白血病，90.9%的自然殺傷細(xì)胞/T細(xì)胞淋巴瘤，60.5%的急性淋巴細(xì)胞白血病，90.0%的急性髓系白血病，100%的慢性粒細(xì)胞白血病的患者標(biāo)本中有SHP-1基因CpG區(qū)域高甲基化[3]。Yang等[4]研究51例肝細(xì)胞癌組織中多個(gè)相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)，結(jié)果多基因發(fā)生甲基化：細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子1（SOCS1）（65%），谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 P（GSTP）（54%），促后期復(fù)合物（APC）（53%），E-鈣粘蛋白（CDH1）（49%）及 p15（49%），其中 53%的肝細(xì)胞癌有2個(gè)以上的基因高甲基化，而在正常組織中為0%。證明，SOCS1等的高甲基化是肝細(xì)胞癌發(fā)生過(guò)程中的普遍事件，且對(duì)腫瘤形成起到重要作用。

2.抑癌基因高甲基化：研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因p16的失活通常都采用CpG島高甲基化的作用機(jī)制。高甲基化導(dǎo)致p16基因失活是腫瘤中經(jīng)常發(fā)生的事件之一。Celebiler Cavusoglu等[5]對(duì)p16和CDH1的研究表明，浸潤(rùn)性乳腺癌的腫瘤組織和其周圍正常的乳腺組織在這2個(gè)基因中的甲基化表達(dá)存在差異而這種差異還存在于在腫瘤周圍的正常乳腺組織和無(wú)腫瘤的正常乳腺組織之間。研究發(fā)現(xiàn)，在許多血液腫瘤中可以檢測(cè)到抑癌基因p15的高甲基化。如：Martin等[6]發(fā)現(xiàn)p15基因的異常與漿細(xì)胞疾病有關(guān)，在多發(fā)性骨髓中p15基因高甲基化是重要的事件；在各種類型的急性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、前髓性白血病、成淋巴細(xì)胞性白血病和淋巴瘤中都有p15基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化。

3.DNA修復(fù)基因的高甲基化：在腫瘤中，可以發(fā)現(xiàn)參與DNA修復(fù)的基因常由于啟動(dòng)子區(qū)高甲基化而失活。如：DNA修復(fù)基因O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-MGMT）近來(lái)的研究證明存在于該基因啟動(dòng)子區(qū)或第一外顯子內(nèi)的CpG島甲基化與其轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)，而且這種變化可以使染色質(zhì)進(jìn)入關(guān)閉狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致核小體定位異常。該變化不僅存在于細(xì)胞系中，也發(fā)生在原位癌中，在肺癌、乳腺癌、大腸癌和淋巴瘤細(xì)胞系中O6-MGMT啟動(dòng)子出現(xiàn)高甲基化。研究證明，BRCA1發(fā)生高甲基化可能與DNA雙鏈斷裂，轉(zhuǎn)錄和重組修復(fù)有關(guān)，這一理論在乳腺癌和卵巢癌中都得到證實(shí)[7]。

除上述基因外，還發(fā)現(xiàn)其他一些基因，如凋亡基因（死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK[8]），視黃酸受體 β（RAR-β），微小 RNA （miRNA）[9]，血管生成抑制基因（THBS1）[10]等在不同腫瘤中存在著高甲基化現(xiàn)象。提示腫瘤的發(fā)生與不同基因發(fā)生高甲基化有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

三、DNA高甲基化的臨床意義

隨著在癌癥的發(fā)生發(fā)展中DNA甲基化異?，F(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，且此現(xiàn)象在確診前就能被檢測(cè)出，提示某些基因的DNA高甲基化水平的檢測(cè)有望成為腫瘤早期診斷的潛在指標(biāo)，甚至可以作為患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、臨床病程監(jiān)控和療效評(píng)估的指標(biāo)。同時(shí)，DNA甲基化是可逆的，因此，使用去甲基化劑使得甲基化的基因因去甲基化而重新活化表達(dá)，為腫瘤的治療提供了新的方法。

1.DNA高甲基化與腫瘤的早期診斷：隨著甲基化檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，特別是甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)，使我們能夠?qū)εR床上的微量樣本進(jìn)行檢測(cè)，如血漿、唾液、痰液等。因此，人們已開始探討以體液DNA作為DNA甲基化臨床分析樣品，期望可早期診斷腫瘤，如采用大便進(jìn)行結(jié)腸癌診斷分析，痰液診斷肺癌，取血清或血漿DNA診斷各種實(shí)體腫瘤[11]。有報(bào)道p16INK4a在肺癌發(fā)病早期（輕度異型增生階段）其啟動(dòng)子CpG島即呈高甲基化狀態(tài)。Palmisano等報(bào)道，在臨床診斷肺鱗癌的前3年，他們就在患者的痰液中檢測(cè)出p16和O6-MGMT基因甲基化。因此，痰液中某些基因的異常甲基化可作為臨床篩查肺癌高危人群的一個(gè)指標(biāo)。因此，隨著研究的不斷深入，DNA高甲基化將在腫瘤的早期診斷方面發(fā)揮重要作用。

2.DNA甲基化與腫瘤預(yù)后判斷：隨著對(duì)甲基化與腫瘤發(fā)展相關(guān)性研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，甲基化改變與傳統(tǒng)的預(yù)后指標(biāo)之間存在密切聯(lián)系。主要包括以下4個(gè)方面：⑴甲基化改變與腫瘤分級(jí)、分期有明顯的相關(guān)性。如Ras相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）甲基化在低分化肺癌中比在高分化中更常見，在結(jié)直腸癌Dukes分期C和D的病例中p16的甲基化率比A和B的高。⑵DNA異常甲基化可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。乳腺癌中細(xì)胞周期素蛋白D2（CyclinD2），RAR-β，RASSF1A和HIN-1（high innormal-1） 的甲基化改變與淋巴結(jié)、骨、腦、肺轉(zhuǎn)移有關(guān)。⑶甲基化可作為腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。如口腔鱗狀細(xì)胞癌時(shí)存在 RECK（reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs） 基因甲基化的患者復(fù)發(fā)率明顯增高[12]。⑷甲基化影響生存期。Fischer等[13]研究了惡性間皮胞瘤中3個(gè)基因的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)多基因較單個(gè)基因甲基化預(yù)后更差。膀胱癌中APC，GSTP1基因發(fā)生異常甲基化時(shí)，患者存活時(shí)間明顯縮短?？梢姍z測(cè)甲基化的改變有助于判斷預(yù)后，進(jìn)而為臨床上的病情監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

3.DNA甲基化譜的建立和意義：Esteller等[14]對(duì)以往有關(guān)甲基化的部分工作進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)根據(jù)腫瘤類型可以建立CpG島甲基化圖譜。腫瘤細(xì)胞在很大程度上保持其細(xì)胞譜系的特征（基因表達(dá)和甲基化模式），故對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA甲基化譜式的分析將為確定腫瘤組織來(lái)源提供必要的信息。因此，人類表觀遺傳協(xié)會(huì)（HEC）于2003年提出和開始實(shí)施全面揭示人類基因組所包含的表觀遺傳學(xué)完整信息，繪制人類基因組甲基化可變位點(diǎn) （methylation variable positions，MVP） 圖譜。以MVP為代表的表觀基因組圖譜，將有助于了解基因調(diào)控，以及正常和疾病狀態(tài)下不同基因相互作用的千絲萬(wàn)縷關(guān)系。它不僅可為腫瘤等疾病的深入研究提供新的詮釋依據(jù)，而且，與其他基因組技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，還可深入到藥物研究，此外，DNA甲基化篩選還可為疾病狀態(tài)提供新的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，為藥物研發(fā)挖掘新的標(biāo)靶。

4.甲基化在臨床治療上的應(yīng)用：由于DNA甲基化不涉及到DNA序列本身的改變，所以這種改變是可逆的，因此，使用去甲基化劑使得甲基化的基因因去甲基化而重新活化表達(dá)。研究已證實(shí)去甲基化酶抑制劑5-脫氧雜氮胞苷（5-aza-CdR） 在體內(nèi)、外均可使大多數(shù)高甲基化的抑癌基因去甲基化恢復(fù)表達(dá)而抑制腫瘤。Momparler等[15]報(bào)道5-Aza-CdR在患有白血病、骨髓增生異常綜合征（MDS）、非小細(xì)胞性肺癌（NSCLC）的病人中進(jìn)行了1期、2期臨床試驗(yàn)，顯示了一定的抗腫瘤作用，可以提高一部分患者的生存率。因此，5-aza-CdR和5-氮-2'-脫氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine），于2007年獲得FDA批準(zhǔn)用于MDS患者的治療[16]。目前在國(guó)外5-aza-CdR是治療MDS推薦的一線藥物[17]。Miasaki等[18]研究顯示5-aza-2-deoxycytidine治療后的甲狀腺癌細(xì)胞系，維甲酸受體beta2重新表達(dá)和生長(zhǎng)抑制。Fan等[19]研究結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿┖虳NMTs抑制劑可以恢復(fù)ERalpha陰性乳腺癌細(xì)胞株對(duì)內(nèi)分泌治療的敏感性。Yang[20]等用三氧化二砷處理淋巴瘤T2細(xì)胞株，使SHP-1基因去甲基化而再表達(dá)。因此，在腫瘤和癌前病變中通過(guò)去甲基化處理可以恢復(fù)某些關(guān)鍵性抑癌基因的功能，從而起到預(yù)防和治療腫瘤的作用。所以，在將來(lái)，DAN甲基化抑制劑將作為抗癌制劑在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。

當(dāng)然對(duì)這些藥物的作用和副作用還需要進(jìn)行更深人的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)研究，因?yàn)閺V泛應(yīng)用去甲基化藥物可以啟動(dòng)一些使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因。

四、尚待解決的問(wèn)題和展望

目前，DNA甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活的機(jī)制已基本明確，但惡性腫瘤中DNA甲基化改變的原因尚未完全清楚。不同的惡性腫瘤中可能存在不同的甲基化譜，同一腫瘤的癌前病變、早期癌以及中晚期癌的甲基化譜有無(wú)改變，尚不得而知。雖然DNA高甲基化與腫瘤發(fā)生的關(guān)系較明確，但腫瘤發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段、多基因的復(fù)雜過(guò)程。DNA高甲基化如何與其它致癌因素協(xié)同作用促進(jìn)腫瘤發(fā)生仍需進(jìn)一步研究。由于目前已知的與腫瘤相關(guān)的甲基化基因數(shù)量非常龐大，所以，即便CpG島甲基化譜具有腫瘤特異性，且大多數(shù)腫瘤都有多個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子甲基化事件，建立合理的多指標(biāo)甲基化圖譜就能為評(píng)估腫瘤風(fēng)險(xiǎn)、早期診斷以及腫瘤預(yù)后提供有用信息，但如何既經(jīng)濟(jì)又有效地對(duì)細(xì)胞全基因組甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，早期發(fā)現(xiàn)異常甲基化的DNA，也成為DNA甲基化研究中一項(xiàng)非常重要的工作。

同時(shí)，目前對(duì)疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是依靠病理組織學(xué)的診斷，但這需要手術(shù)或活檢來(lái)獲得標(biāo)本，而獲得這些標(biāo)本的過(guò)程均是有創(chuàng)的，因此對(duì)于那些不能耐受手術(shù)檢查或者不具備相應(yīng)檢查條件的患者，有創(chuàng)檢查對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)和篩選腫瘤不適用。腫瘤相關(guān)基因啟動(dòng)子異常甲基化是細(xì)胞癌變過(guò)程中的一個(gè)早期事件，可以作為腫瘤發(fā)生的敏感性生物標(biāo)志物。因此，如何有效地利用比較容易獲得一些生物樣品如外周血的血漿/血清、唾液、痰、尿、糞便等來(lái)檢測(cè)腫瘤組織中存在的腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子高甲基化，是醫(yī)務(wù)工作者的當(dāng)務(wù)之急和研究方向。

盡管，體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-CdR通過(guò)去甲基化作用可使多種CpG島高甲基化的抑癌基因重新表達(dá)而恢復(fù)抑癌功能。但是這些藥物均無(wú)基因特異性,不能選擇性地活化沉默的目的基因，從而會(huì)引起整體的低甲基化；這類藥物的活化作用可逆，療效依賴于藥物的持續(xù)存在；同時(shí)在大劑量應(yīng)用時(shí)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞有毒副作用。因此，我們還應(yīng)該在逆轉(zhuǎn)基因甲基化的特異性、療效的持續(xù)性、可控制性等方面進(jìn)一步研究。

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