溶菌酶的研究與應用

吳連春，張秀玲

1.河北聯(lián)合大學，河北 唐山 063020 2.河北聯(lián)化學工程學院，河北 唐山 063009

溶菌酶，全稱為1，4-β-N-溶菌酶，又稱胞壁質酶或粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?是一種對微生物的細胞壁特別是致病細菌中的黏多糖具有專門作用的水解酶，通過切斷N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵聯(lián)結，解體肽聚糖支架，從而在內部滲透壓的作用下使細胞脹裂，細菌裂解。溶菌酶還可與帶負電的病毒蛋白結合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒喪失活性。因此溶菌酶具有抗菌、消炎、殺毒等作用[1-2]。

由于溶菌酶能夠選擇性地分解微生物的細胞壁，并且自身沒有毒害，因此作為一種天然、安全的殺菌劑和防腐劑，在食品工業(yè)、醫(yī)藥制劑、日用化工等行業(yè)被普遍重視。隨著開發(fā)和應用研究的進一步深入，溶菌酶的發(fā)展前景將會十分廣闊。

1 溶菌酶的結構與性質

溶菌酶是一種葡萄糖苷酶，其中雞蛋清溶菌酶是目前研究最清楚的一種溶菌酶，它是由18種129個氨基酸殘基2200個原子組成的單肽鏈蛋白質，分子量14388～18000[3]。

純品溶菌酶為粉末狀白色結晶，無嗅、味甜，易溶于水、乙醇，不溶于丙酮、乙醚等[4]；在酸性溶液中其化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均較強，在pH=3，100oC條件下加熱處理45min仍保持活性 ；在堿性條件下化學性質不穩(wěn)定，易被破壞，熱穩(wěn)定性也很差[5]。

2 溶菌酶的分離純化方法

由于溶菌酶的來源眾多，其分離純化的方法也有多種。目前主要有直接結晶法、離子交換層析法、親和層析法以及超濾法、膜色譜法和反膠團法等。

2.1 直接結晶法

結晶法是提取溶菌酶的傳統(tǒng)方法，原理是在蛋清中加入一定量的中性鹽如氯化物、碘化物或碳酸鹽等鹽類，再調節(jié)至溶菌酶的等電區(qū)靜置，即可有溶菌酶晶體慢慢析出，而大多數(shù)蛋白質卻仍留在溶液中，經(jīng)過濾得溶菌酶結晶，通過重結晶可獲得精致的溶菌酶。

此法設備簡單、操作容易、投資不大。但由于結晶過程中的條件不易控制，且溶菌酶容易失活，影響質量；同時處理后的蛋清不易回收利用，使成本增大。

2.2 離子交換層析法

離子交換層析法用于溶菌酶分離始于上世紀8O年代，具有操作簡便、成本低、效率高的特點，并可重復使用及實現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)自動操作，因此而成為溶菌酶生產(chǎn)的常用方法[7]。

通常選擇弱酸性陽離子交換樹脂進行分離。目前用于溶菌酶分離純化的離子交換劑主要有Duolite-464、724、732型弱酸性陽離子交換樹脂，D903、D201大孔離子交換樹脂，CM、DEAE-纖維素，羧甲基纖維素（CMC）和羧甲基瓊脂糖，CM.Sephadex陽離子交換樹脂，Duolite C-464樹脂，CM.Toyope.樹脂，大空隙苯乙烯系強堿性陰離子交換吸附樹脂等[6，8]。

2.3 親和層析法

親和層析法是利用蛋白質或酶與其配體之間的專一性親和力，使酶與底物形成復合物，在一定條件下進行分離而得到純凈酶的方法。常用的吸附劑為幾丁質及其衍生物，如：幾丁質粉、羧甲基幾丁質、幾丁質包埋纖維素、脫氨幾丁質粉、N-?；瘹ぞ厶?、脫氨再生幾丁質凝膠等[9]。

此法對各種來源的溶菌酶均可應用，對經(jīng)化學修飾而失活的溶菌酶也能進行分離純化。但僅適用于分離純化微量溶菌酶，大規(guī)模生產(chǎn)尚難以適用。

2.4 超濾

超濾法是一種新興分離純化技術，是通過控制超濾膜孔徑大小，來濾除雜質、水及小分子物質，從而達到分離獲得產(chǎn)物的目的[8]。

超濾法的優(yōu)點是可以獲得高產(chǎn)量和高純度的產(chǎn)品，將超濾法與結晶法、離子交換法或親和色譜法等結合使用，可進一步提高純度，獲得精制溶菌酶。

2.5 膜色譜法

膜色譜技術是將膜分離與液相色譜相結合的一種新型分離技術，其中親和膜色譜法兼具了膜分離與親和分離的特點，具有純度高，壓降小，分離快等特點，且在分離過程中生物大分子變性幾率小，容易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)[10]；離子交換膜色譜法則是通過膜介質表面的基團與目標蛋白質進行離子交換而進行分離的，其特點是操作條件溫和，蛋白質不容易失活[11]。

2.6 反膠團法

反膠團萃取是通過在有機溶劑中加入適量表面活性劑，在溶液中形成的反膠團來進行分離純化的方法，是近年發(fā)展起來的一種新的萃取方法，為有機溶劑萃取技術的應用擴大了范圍[11]。

3 溶菌酶活性復性與活性測定

3.1 溶菌酶的活性復性

在溶菌酶的生產(chǎn)或應用過程中，由于工藝條件或環(huán)境因素的變化，容易造成酶失活變性，因此需要通過采取適當措施，保持或恢復溶菌酶的活性，從而減少損失。如Karuppiah等[12]研究表明，向復性溶液中加入適量的β-環(huán)糊精，可使變性的碳酸脫水酶的復性率達到80%。

3.2 溶菌酶的活性測定

測定溶菌酶活性的方法，主要有比濁法、瓊脂板擴散法、紫外分光光度法、比色測定法、瓊脂火箭糖電泳法和高效液相色譜法等。這些方法各有不同特點，其中比濁法和瓊脂板擴散法方法較為常用，但干擾因素多，實驗結果的重現(xiàn)性差。瓊脂火箭糖電泳法和高效液相色譜法的測定效果最為理想[13]，簡便快速、穩(wěn)定靈敏，測量結果準確可靠，是比較好的方法。在比濁法基礎上改進的微量快速比濁檢測溶菌酶的方法具有快速、準確、靈敏的特點。

4 溶菌酶的應用

4.1 在食品工業(yè)中的應用

溶菌酶作為一種無毒、無副作用安全性很高的天然蛋白質，成為食品防腐劑和營養(yǎng)保健品的優(yōu)選對象。現(xiàn)已應用于如水產(chǎn)品、乳制品、肉食品、糕點、料酒、清酒及飲料等產(chǎn)品。溶菌酶的殺菌屬于冷殺菌，因此可以避免高溫殺菌對食品營養(yǎng)和風味的破壞作用。將溶菌酶添加到乳粉中，能使牛乳人乳化。

4.2 在生物科學研究中的應用

由于溶菌酶能破壞細菌細胞壁，因此用溶菌酶處理格蘭氏陽性細菌能得到原生質體，可用于菌體內容物質的提取。在適當緩沖條件下用溶菌酶處理對溶菌酶敏感的菌體懸浮液，再經(jīng)超聲波、冷凍、離心分離等方法進一步精制，所得的菌體物質，可用以提取制造核酸、酶及活性多肽等活性物質[14]。隨著生物科學的發(fā)展，溶菌酶已成為基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程中非常重要的工具酶，對溶菌酶制劑的需求量也與日俱增 。

4.3 在醫(yī)療中的應用

作為酶類抗菌藥，溶菌酶能參與黏多糖的代謝，如配合內服與外用藥，可使其對微生物的感染發(fā)揮出更強的消炎作用。溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效，并具有多種藥理作用，因此廣泛用于副鼻竇炎、咽喉炎、扁平苔蘚的治療。還可用于預防和治療病毒性肝炎，尤其對輸血后肝炎及急性肝炎的效果較為顯著。

5 結論

溶菌酶作為一種天然蛋白質，具有抗菌、殺毒和消炎等作用，并能在胃腸內促進營養(yǎng)物質的消化與吸收，對人體沒有毒害，集藥理、保健和防腐3種功能于一體，是一種安全性很高的食品保鮮防腐劑、營養(yǎng)保健品和藥品。

由于溶菌酶來源廣泛，不同來源溶菌酶又有其不同的特殊性，因此，應充分研究掌握不同溶菌酶的酶學特性，同時研究不同條件如pH值、離子強度等因素對其活性的影響，探究酶活優(yōu)化條件和調空方法。另外，作為防腐劑使用溶菌酶時，應先弄清楚是何種微生物導致食品腐敗，以便對癥下藥，確實發(fā)揮防腐作用。另外，還應研究不同來源溶菌酶之間及與其他物質配合使用的協(xié)同作用。

我國溶菌酶的研究、應用起步較晚，目前國內蛋清溶菌酶年產(chǎn)量不足50t，特別是高活性的溶菌酶供應還不能滿足日益增長的需求。我國生物酶工程研究已多次列為國家“863”計劃及“十五計劃”等的重點科研攻關項目。隨著我國經(jīng)濟的騰飛和生物、化工等工業(yè)的發(fā)展，對溶菌酶的需求量在不斷增加。因此，研究、開發(fā)和擴大溶菌酶的生產(chǎn)有著廣泛的發(fā)展前景。

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