結(jié)核分子生物學(xué)診斷技術(shù)的研究進展

余春開 馮瑞娥

結(jié)核病是嚴重危害人類健康的全球性傳染病之一，我國是結(jié)核病高發(fā)區(qū)，且近年結(jié)核病發(fā)病率有逐年增加的趨勢;另外由于AIDS的蔓延和各種原因引起的免疫缺陷，導(dǎo)致不典型結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)病率也逐年增加。早期診斷、早期治療和合理治療是治療結(jié)核病的關(guān)鍵。目前臨床上常用的結(jié)核病診斷方法有細菌學(xué)涂片抗酸染色、活檢病理診斷和體液或組織培養(yǎng)。細菌學(xué)涂片和活檢病理抗酸染色找到抗酸桿菌可以確診結(jié)核，但是陽性率很低，而且不能區(qū)別結(jié)核桿菌和不典型結(jié)核桿菌。另外麻風(fēng)桿菌也可以表現(xiàn)為抗酸染色陽性。體液或活檢組織的分枝桿菌培養(yǎng)陽性可明確診斷結(jié)核及菌型，但是培養(yǎng)時間長，且陽性率非常低。雖然新的培養(yǎng)法BACTEC法顯著縮短了培養(yǎng)、菌型鑒定結(jié)果的報告時間，但由于該法使用放射性底物而使它的應(yīng)用受到了限制。并且有些類型分枝桿菌不能在培養(yǎng)基中生長。以上這些方法都不能滿足臨床對結(jié)核病早期診斷和早期治療的要求，很多結(jié)核病病人不能及時的得到確診而延誤病情;甚至有部分病人被誤診，而接受了錯誤的治療使病情加重。因此要求我們尋找快速有效的檢測方法。利用分子生物學(xué)方法檢測分枝桿菌DNA特異性高，與培養(yǎng)法具有可比性，且敏感性較高。本文對各種分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核桿菌和不典型分枝桿菌診斷中的研究進展及在石蠟包埋組織中的應(yīng)用做簡要綜述。

一、聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)

PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域。該技術(shù)的優(yōu)點是其強大的擴增能力，能把極微量的DNA擴增到瓊脂凝膠電泳能檢測到的水平;缺點是微量的污染DNA經(jīng)擴增后能使結(jié)果呈假陽性。因此避免污染對于實驗成功是非常關(guān)鍵的。嚴格實驗室管理、規(guī)范操作和選擇特異性好的引物都有助于減少假陽性的發(fā)生。

為了提高PCR診斷的敏感性和特異性，很多學(xué)者通過改變實驗具體操作或使用不同材料而建立了改良PCR方法用于檢測分枝桿菌。

1.巢式PCR:相對于普通PCR，巢式PCR的敏感性和特異性更高。此技術(shù)使用兩對PCR引物擴增完整的片段，第一對PCR引物(又稱外引物)擴增片段和普通PCR相似，第二對引物稱為巢式引物，又稱內(nèi)引物，結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片斷短于第一次擴增，因此擴增結(jié)果更具有特異性。臨床標本如痰、胸水、腦脊液等巢式PCR檢測的敏感性和特異性均較好。有學(xué)者嘗試在福爾馬林固定石蠟包埋組織中用巢式PCR檢測分支桿菌［1-6］。Alcantara-Payawal等［3］以IS6110序列引物分別用傳統(tǒng)PCR和巢式PCR檢測石蠟組織的結(jié)核桿菌，結(jié)果顯示巢式PCR的敏感性明顯高于傳統(tǒng)PCR。Park等［4］用巢式PCR檢測81例臨床懷疑結(jié)核的石蠟組織，巢式PCR結(jié)果與抗酸染色結(jié)果比較顯示巢式PCR很大程度上提高了石蠟組織診斷結(jié)核的陽性率。Stephan Schulz等［6］對190例懷疑結(jié)核的石蠟組織利用HSP 65序列進行巢式PCR檢測，結(jié)果190例中119例分枝桿菌DNA檢測陽性，其中71例符合典型結(jié)核桿菌;41例發(fā)現(xiàn)不典型分枝桿菌DNA。而AZOV等［5］結(jié)合HSP 65和IS 6110序列對46例石蠟包埋組織進行巢式PCR檢測，對20例抗酸染色陽性臨床最終診斷結(jié)核的病例敏感性為100%，且檢測結(jié)果對結(jié)核桿菌復(fù)合群和鳥型分枝桿菌均特異。而26例抗酸染色陰性不明原因的壞死性肉芽腫性炎病例，其中9例巢式PCR結(jié)果符合結(jié)核桿菌，4例符合不典型結(jié)核桿菌。巢式PCR是檢測石蠟組織結(jié)核桿菌的簡單快速有效的方法，且同時能鑒別結(jié)核桿菌和不典型結(jié)核桿菌。

2.PCR-免疫層析法:把PCR與免疫層析法相結(jié)合。免疫層析法由三部分組成:浸滲有膠體金和鼠IgG的玻璃纖維絲區(qū);涂有抗洋地黃、抗異硫氰酸熒光素和抗鼠IgG抗體的硝酸纖維素膜區(qū);以及用于吸取緩沖液的增厚濾紙區(qū)。標本經(jīng)PCR擴增后，把樣品滴到檢測板上，數(shù)分鐘后即可判讀結(jié)果。Suzuki等［7］建立了PCR-免疫層析法檢測臨床懷疑結(jié)核的138例痰標本，38例培養(yǎng)(+)涂片(+)的病例PCR-免疫層析法陽性率100%，14例培養(yǎng)(+)而涂片(-)或(±)的病例陽性率分別為9.1%和66.6%。Soo等［8］用IS 6110和Rv3618序列巢式PCR-免疫層析法直接檢測1500例臨床痰標本，可診斷并鑒別結(jié)核桿菌復(fù)合群和結(jié)核桿菌。免疫層析法是一種簡單的可靠的方法，與酶聯(lián)免疫吸附法和凝膠電泳相比，5 min內(nèi)就可肉眼判讀結(jié)果。PCR-免疫層析法是一種快速檢測方法，且敏感性和特異性與培養(yǎng)法相近，不需要特殊的技術(shù)和儀器。

3.多重PCR:是指在同一PCR反應(yīng)體系中，加入多對不同引物，根據(jù)它們的退火溫度的不同進行PCR擴增，而在同一反應(yīng)體系中得到不同的PCR產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳后出現(xiàn)多條條帶。侯瑞生等［9］以IS 6110及HSP 65為PCR引物對臨床標本培養(yǎng)分離株進行多重PCR檢測，結(jié)果顯示多重PCR體系檢測結(jié)核桿菌DNA的靈敏性最低為30～210個結(jié)核桿菌，對結(jié)核病病例和對照標本檢測的靈敏性為94.6%，特異性為100%。Klemen等［10］提出三步法進行篩選性診斷:第一步用IS6110引物PCR檢測結(jié)核桿菌DNA，如果陽性就沒有必要進行第二和三步;如果陰性，進入第二步;第二步用HSP 65引物PCR檢測分枝桿菌病，如果陽性，進入第三步進一步分型;第三步加入多條特異性引物進行多重PCR檢測不典型分枝桿菌，鑒別出不同菌型。也有學(xué)者報道多重PCR用于石蠟組織中結(jié)核桿菌的檢測，李子玲等［11］應(yīng)用三對具有特異性的寡核苷酸引物直接對石蠟組織進行多重PCR擴增。這三對引物HSP 65、IS 6110及人類β2-珠蛋白基因的部分序列。此種多重PCR方法特異性和敏感性高，且可以鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體及非結(jié)核分枝桿菌DNA。多重PCR的優(yōu)點是可以根據(jù)需要選擇不同菌株特異性引物進行檢測，臨床上有部分病例是屬于兩種或兩種以上分枝桿菌混合性感染或者夾雜其他特殊感染，利用多重PCR檢測可以避免混合性感染病例被漏診。

4.定量PCR:是在定性PCR基礎(chǔ)上改進擴增方法并采用新的檢測方法進行定量。實時熒光定量PCR擴增時加入一對引物和一個特異性的熒光探針，利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。Hillemann等［12］采用普通PCR和實時PCR方法分別檢測石蠟組織的結(jié)核桿菌DNA，結(jié)果24例臨床診斷結(jié)核的病人，實時PCR結(jié)核桿菌檢測的敏感性為66.7%(16/24)，而普通PCR的敏感性只有33.3%。近年有學(xué)者把定量PCR與巢式PCR或多重PCR相結(jié)合，提高了敏感性和特異性。Takahashi等［13］建立了實時定量PCR和巢式PCR相結(jié)合的技術(shù)檢測結(jié)核桿菌，這種技術(shù)結(jié)合了巢式PCR高敏感性和定量PCR能精確定量的優(yōu)點，避免了巢式PCR費時費力且容易出現(xiàn)污染的缺點。Richardson等［14］建立了多重實時定量PCR，即結(jié)合多重PCR和實時定量PCR技術(shù)，他們采用此技術(shù)對314例臨床標本培養(yǎng)分離株進行檢測，結(jié)果與培養(yǎng)法比較敏感性和特異性達到99%，且因為應(yīng)用多對特異性引物，可快速對分枝桿菌進行分型。實時定量PCR是一密閉系統(tǒng)，減少了實驗室環(huán)境對其的污染，大大降低了假陽性率，與常規(guī)PCR相比，特異性更強，自動化程度更高。

5.Amplicor PCR:是由瑞士Roche公司開發(fā)研制的標準化、商品化試劑盒，該試劑盒有三個不同的小盒:標本處理盒、擴增盒和鑒定盒。應(yīng)用種特異性探針可對結(jié)核分枝桿菌和不典型分枝桿菌進行菌種鑒定。不少文獻報道Amplicor PCR對于檢測臨床標本(包括痰液、胃內(nèi)抽吸液)的分枝桿菌是一種快速、特異的診斷方法，且敏感性與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相近［15-17］。Peter-Getzlaff等［18］建立了新的Amplicor PCR引物，生物素標記的引物KY18和K75用于直接檢測不典型分枝桿菌(其中包括堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌等)。痰涂片陽性和陰性病例的敏感性分別為100% 和47.9%，特異性為97.7%。Oh EJ等［19］利用分枝桿菌生長指示管和羅氏Amplicor PCR系統(tǒng)分別檢測和鑒定分枝桿菌，兩者的敏感性和特異性均較高，并提出兩者結(jié)合是臨床快速診斷結(jié)核桿菌和不典型分枝桿菌非常有用的方法。Amplicor PCR是一種快速檢測方法，具有高度敏感性、特異性和可重復(fù)性，而且操作簡單，無需昂貴設(shè)備，無放射性污染問題。

二、連接酶鏈反應(yīng)(the ligase chain reaction，LCR)

LCR與PCR技術(shù)相似，是近年來發(fā)展起來的新分子生物學(xué)技術(shù)。利用DNA連接酶特異地連接雙鏈DNA片段，經(jīng)變性-退火-連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因序列大量擴增。LCR的引物是兩對完全已知的互補的引物，引物長度為20～26個，以保證引物與靶序列的特異性結(jié)合，因此可準確檢測基因序列中單個基因突變。另外該擴增系統(tǒng)是完全密閉的，污染少。但是LCR的DNA擴增技術(shù)較PCR慢，在檢測微量靶DNA時也不及PCR。用LCX診斷試劑盒對臨床標本進行LCR擴增，LCR診斷結(jié)核的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均較高，可用于臨床標本的篩查［20-23］。Patzina等［24］提出利用LCR技術(shù)結(jié)合抗酸染色和抗BCG免疫組化，可提高外檢石蠟組織的結(jié)核確診率。

三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single-strand conformation polymorphism，SSCP)

SSCP技術(shù)是在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物中單堿基突變。其原理是DNA單鏈若堿基序列不同，其空間構(gòu)象也會不同，若某一片段的堿基序列發(fā)生突變，甚至是單個堿基的變化(點突變)，那么其單鏈的空間構(gòu)象也會發(fā)生變化。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)變性后可產(chǎn)生兩條互補的單鏈，快速復(fù)性后，經(jīng)凝膠電泳、顯色分析結(jié)果。由于不同構(gòu)象的DNA片段具有不同的遷移率，因而在凝膠上會顯現(xiàn)出不同的帶型。與結(jié)核標準株的帶型進行比較，即可判定待測樣品是否存在突變。有不少文獻報道關(guān)于SSCP用于結(jié)核桿菌基因的突變和耐藥性的快速檢測［25-27］。該方法簡單、快速，不需要特殊的儀器，成本較低。檢測耐藥基因有很強的特異性和較高的敏感性，與常規(guī)耐藥性測定方法有很高的符合率，結(jié)果容易觀察，而且能長期保存，又可同時分析多個樣本，很適用于臨床檢測。不足之處是電泳條件要求較嚴格，只能用于確定有無基因突變而不能確定突變的部位和性質(zhì)。

四、限制性片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)

PCR-RFLP技術(shù)是PCR和限制性內(nèi)切酶相結(jié)合的技術(shù)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，進行凝膠電泳分析，不同分枝桿菌酶切片段的數(shù)量或大小不同，電泳圖譜呈現(xiàn)多態(tài)性。因此PCR-RFLP技術(shù)可用于鑒定分枝桿菌菌種。另外當PCR擴增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶的酶切位點堿基發(fā)生突變，或酶切位點之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，就導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，因此PCR-RFLP技術(shù)也用于分枝桿菌的基因突變和耐藥性檢測。Agacayak等通過對65 Ku蛋白基因的PCR產(chǎn)物進行限制性酶切分析，能準確檢測出結(jié)核桿菌的屬內(nèi)歸屬。Mokrousov等［28］報道用RFLP檢測到結(jié)核桿菌katG315和rpoB531的基因突變。此法特異性較高，但只能分析已知序列特定位點的基因突變，且此種技術(shù)操作復(fù)雜且費時間。

五、鏈置換擴增反應(yīng)(strand displacement amplification，SDA)

SDA是一種等溫的體外DNA擴增方法，利用限制性內(nèi)切酶HincⅡ在半磷酸巰基化識別位點的未保護鏈上產(chǎn)生一個缺口，然后在外切酶活性喪失的DNA聚合酶I大片段的作用下，從引物切口處向3端延伸，合成的新鏈可將切口下游區(qū)的DNA鏈取代，被替換的DNA鏈反過來又可以作為模板，與引物結(jié)合，并在HincⅡ作用下產(chǎn)生切口后，又產(chǎn)生一條新鏈和一條取代鏈，如此往復(fù)循環(huán)，從而達到指數(shù)擴增的效果。擴增產(chǎn)物經(jīng)生物素標記DNA探針雜交后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試驗進行檢測，其檢測純化DNA低限為5～50個基因拷貝數(shù)。譚耀駒等［29］用SDA技術(shù)直接檢測臨床標本如痰、胸水和腦脊液，實驗中應(yīng)用BDProbeTec ET分枝桿菌測試系統(tǒng)(美國BD公司)和MTBC直接檢測試劑盒，結(jié)果顯示敏感性高于FQ-PCR，而特異性與FQ-PCR相近。Johansen等［30］用SDA技術(shù)直接檢測石蠟包埋組織，BDProbeTec ET檢測結(jié)核桿菌的敏感性為90%，特異性為100%。該檢測方法需要特殊儀器——熒光分光光度計，因此限制了在臨床的廣泛應(yīng)用。

六、基因芯片技術(shù)(Gene Chips)

基因芯片的基本原理是將大量已知序列的寡聚核苷酸探針固定在玻璃等支持物上，然后與待測樣本的DNA或RNA進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。該法可以同時一次性完成對樣品的多個序列進行檢測和分析?；蛐酒夹g(shù)具有快速、高效的優(yōu)點，可用于診斷分枝桿菌混合感染等復(fù)雜病例。1998年，Gingeras等［31］首次應(yīng)用高密度寡核苷酸陣列對10種121株同時鑒定分枝桿菌菌種和結(jié)核分枝桿菌耐利福平基因rpoB突變。利用結(jié)核分枝桿菌rpoB基因保守區(qū)705bp特異核苷酸序列探針與基因芯片雜交。1999年Troesch等［32］開發(fā)出首塊結(jié)核病相關(guān)芯片，包括2部分，一部分是在結(jié)核分枝桿菌有種間多態(tài)性的16S rRNA基因片段，借以鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌;另一部分則用于分析耐利福平菌株rpoB基因突變的發(fā)生情況，可用于結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥性的快速檢測。Mikhailovich等［33］用基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因的點突變和基因重排來判定結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥性，在利福平耐藥菌株中檢出30個DNA突變體(約占所有耐藥模式的95%)，檢測時間縮短到1.5 h。該技術(shù)最大的優(yōu)勢在于能夠同時分析成千上萬個基因。使用芯片技術(shù)檢測結(jié)核桿菌、菌種鑒定、研究耐藥基因以及基因組比較分析有靈敏快速、特異性高等特點，少量的DNA足夠進行芯片檢測，無須進行培養(yǎng)，具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。但由于基因芯片制作?fù)雜，且需要昂貴的特殊儀器而限制了它在臨床應(yīng)用上的普及。

七、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增反應(yīng)即基因探針擴增直接試驗(AMTDT)

由DNA介導(dǎo)的等溫rRNA擴增法，擴增子應(yīng)用吖啶酯標記的化學(xué)發(fā)光探針進行核酸雜交保護實驗，通過照度計檢測雜交探針的相對發(fā)光值，以RLU≥3×104判定為陽性。該rRNA序列在核酸中存在2×103拷貝數(shù)，應(yīng)用AMTDT可使特異性靶rRNA序列擴增109倍。Ruiz-Manzano等［34］利用AMTDT擴增試劑盒直接檢測石蠟組織中的結(jié)核桿菌，對AMTDT和LCxMTB兩種檢測方法進行比較，兩者的敏感性分別為52.6%和63.2%，兩者同時使用時陽性率達80.7%。

八、雜交信號放大方法(hybridization signal amplification method，HSAM)

HSAM是一種新的結(jié)核分枝桿菌分子檢測方法，利用Dynal磁珠雜交分離靶基因省去了DNA提取步驟，使得檢測過程簡便易行，可在數(shù)小時內(nèi)完成;自組裝的納米顆粒作為報告信號的結(jié)合載體，擁有數(shù)量巨大的親和素位點，增加了報告信號(Biotin-FITC)數(shù)量，放大了信號強度，提高了檢測的靈敏度。王海河等［35］用HSAM法檢測合成的IS6110靶基因、結(jié)核分枝桿菌標準菌株、大腸埃希菌和表皮葡萄球菌，結(jié)果顯示HSAM最少能檢測到結(jié)果表明HSAM最低可檢測10個靶基因和結(jié)核分枝桿菌，與PCR方法靈敏度相近，標準菌株檢測結(jié)果陽性，大腸埃希菌和表皮葡萄球菌均為陰性。并用HSMA直接檢測124份臨床結(jié)核患者標本(包括痰、胸水和腹水)，與培養(yǎng)法進行對比，敏感性為87.7%，特異性92.2%［36］。HSAM具有高靈敏度、高特異性及操作簡便快速等特點，可肉眼直接觀察檢測結(jié)果。檢測過程簡便快捷，不需要昂貴的設(shè)備。

早期診斷是結(jié)核病治療的關(guān)鍵。分子生物學(xué)技術(shù)是診斷結(jié)核快速、有效的方法，特異性和敏感性均較高，能夠滿足結(jié)核早期診斷的要求，因此分子生物學(xué)技術(shù)診斷結(jié)核在臨床應(yīng)用上有良好的前景。重復(fù)性好、自動化程度高且結(jié)果可靠的分子生物學(xué)診斷技術(shù)的研究是今后的重點研究方向。

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