基于牙釉質(zhì)基因巢式PCR性別鑒定超微量DNA檢測方法的建立

唐紀(jì)偉 高慶華

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是一種體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。自PCR技術(shù)問世以來，以其快速、準(zhǔn)確、敏感和簡便等優(yōu)點(diǎn)在醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)和胚胎移植前遺傳學(xué)診斷(PGD)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［1－3］?，F(xiàn)在，PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于牛、羊等動物的胚胎性別鑒定，還建立了許多基于PCR技術(shù)的家畜胚胎性別鑒定方法。隨著研究的進(jìn)一步深入，要求PCR性別鑒別技術(shù)在原有基礎(chǔ)上更加快速、敏感和簡捷。巢式PCR法是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它是根據(jù)一個(gè)性別特異基因設(shè)計(jì)一對外引物以得到被測基因較長的擴(kuò)增產(chǎn)物，再根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)第二對引物(內(nèi)引物)對產(chǎn)物進(jìn)行第二次擴(kuò)增。巢式PCR經(jīng)過兩次擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物的量增加，結(jié)果更容易判斷，同時(shí)巢式引物的使用增加了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，提高了準(zhǔn)確度［4］。

本實(shí)驗(yàn)采用巢式PCR擴(kuò)增超微量山羊血液基因組DNA進(jìn)行性別鑒定，旨在建立超微量DNA檢測方法，在對家畜早期胚胎進(jìn)行鑒定時(shí)，盡可能少的切取胚胎，以減少對胚胎的傷害，提高胚胎移植的成功率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2×HSTMTaq mix(廣東東盛公司)、TaKaRa DL－2000 DNA marker、瓊脂糖(大連寶生物公司);AB2400型PCR儀、DYCP－31BM型水平電泳槽(北京六一儀器廠)、JY－ECPT3000型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、凝膠成像儀;血液樣品(采自阿克蘇地區(qū)當(dāng)?shù)厣窖?。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)羊AMEL基因序列，采用BLAST和Clustal W程序設(shè)計(jì)巢式引物，巢式外引物(amelF1:5'－CATGGT GCCAGCTCAGCAG －3'和 amelR1:5'－CCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC－3')，巢式內(nèi)引物(amelF2:5'－CAGCAACCAATGATGCCAGTTC－3'和amelR2:5'－GTCTTGTCTGTTGCTGGCCA －3')，兩對引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 DNA提取、稀釋及PCR擴(kuò)增

1.3.1 血液基因組DNA的提取

山羊血液樣品用消化緩沖液(10 mmol/L Tris－ HCl(pH 8.0)，10 mmol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，2%SDS)和蛋白酶 K(終濃度 0.5 mg/mL)55℃消化過夜后，加入等體積Tris飽和酚，溫和顛倒混勻10 min，10000 r/min離心10 min，寬口徑吸管吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至新EP管中;加入等量酚、氯仿、異戊醇(體積比25:24:1)混合液，按上述方法各抽提一次;加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇、1/10體積的NaAc(pH 5.2)，來回顛倒沉淀DNA;基因組DNA析出后，棄上層液體，用70%乙醇洗滌兩次;留少量乙醇，自然揮發(fā)至快干時(shí)，加入滅菌三蒸水使DNA完全溶解，分裝并保存于－20℃冰箱中。

1.3.2 DNA樣品濃度的測定和稀釋

取基因組DNA 20μL，用滅菌超純水稀釋到2000μL，以滅菌超純水作空白對照，應(yīng)用CRAY100紫外分光光度計(jì)RNA－DNA估算3.0軟件包測定其濃度后，將樣本梯度稀釋至 10 ng/μL、1ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL。

1.3.3 PCR 反應(yīng)

血液DNA巢式PCR擴(kuò)增模板第一輪PCR擴(kuò)增，其中 Taq mix(含 50 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris－ HCl、3 mmol/L MgSO4、400 mmol/L dNTPs、0.1U/μLTaq DNA 聚合酶、溴酚藍(lán)等)10μL，10 μmol/L的上下游巢式外引物各0.8μL，1μL模板(10 ng)，8.2 μL滅菌超純水(共20 μL);預(yù)變性94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán);最后72℃ 延伸5 min。第二輪PCR擴(kuò)增，其中Taq mix 5μL、上下游巢式內(nèi)引物引物各0.4 μmol/L，取 1μL第一次 PCR產(chǎn)物作模板(共10μL)，循環(huán)參數(shù)為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，62℃30 s，72℃ 30 s，共 30個(gè)循環(huán);最后 72℃ 延伸5 min。

超微量模板第一輪 PCR擴(kuò)增，其中 Taq mix 4μL，10μmol/L的上下游巢式外引物各0.15μL，1μL模板(10 pg)，14.8 μL滅菌超純水(共20μL);預(yù)變性 94℃ 5 min;94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共25個(gè)循環(huán);最后 72℃ 延伸5 min。第二輪PCR反應(yīng)其中4μL Taq mix、10μmol/L的上下游巢式內(nèi)引物各0.4μL，取4.6μL第一次PCR產(chǎn)物作模板(共10μL)，循環(huán)參數(shù)為:94℃ 5 min;94℃30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。

1.4 凝膠電泳分析

取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠(含 0.05 μg/mL EB)，電壓 75 V，電泳時(shí)間30 min，紫外透射儀觀察擴(kuò)增結(jié)果，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)兩條帶者判定為雄性，出現(xiàn)一條帶者判定為雌性，在全自動數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)上拍照。

2 結(jié)果

采用巢式PCR對血液基因組DNA擴(kuò)增后雌性山羊只得到一條帶，雄性山羊得到兩條帶(圖1);對圖1中顯示經(jīng)過第二次擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于只經(jīng)過一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物量，陰性對照的結(jié)果顯示，從樣品采集到PCR擴(kuò)增的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中沒有發(fā)生DNA污染。巢式PCR的敏感性比一次PCR高100倍以上，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)連續(xù)10倍梯度稀釋法研究的結(jié)果，用巢式PCR法擴(kuò)增10 pg量的基因組DNA仍能得到預(yù)期的陽性結(jié)果(圖2)。

圖2 10 pg量山羊基因組DNA AMEL基因片段巢式引物的擴(kuò)增性別鑒定

3 討論

AMEL 基因同時(shí)存在于牛［5］、羊［6］、豬［7］和人［8］中X 和Y 染色體上(AMELX，AMELY)，根據(jù)其同源區(qū)長度在兩條性染色體上的不同，只需設(shè)計(jì)一對引物就能擴(kuò)增出不同長度的基因片段。雌性基因組DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢驗(yàn)得到對應(yīng)X染色體的一條非特異性條帶，而雄性基因組的PCR產(chǎn)物可以得到兩條帶，分別對應(yīng)X染色體的非特異性條帶和 Y 染色體的特異性條帶［9］。Michael等［10］的試驗(yàn)證明PCR鑒定可精確到單個(gè)細(xì)胞，陳從英等［11］對牛的胚胎細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，靈敏度可達(dá)10個(gè)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過擴(kuò)增山羊AMEL基因鑒定性別的方法對巢式PCR反應(yīng)的敏感性進(jìn)行了檢測，通過連續(xù)梯度稀釋法(10－2μg/μL、10－3μg/μL，10－4μg/μL，10－5μg/μL)檢測的結(jié)果，可以對 10 pg量的山羊基因組DNA(約3個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行擴(kuò)增。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)巢式PCR比一次PCR反應(yīng)的敏感性高100倍以上［1］。由于PCR反應(yīng)的高靈敏性，極易受到污染，影響鑒定結(jié)果。因此應(yīng)該認(rèn)真對待每一步操作，盡可能避免污染因素對鑒定結(jié)果的影響。圖1的陰性對照的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)中從樣品采集到PCR擴(kuò)增的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中沒有發(fā)生DNA污染。

本實(shí)驗(yàn)是在對胚胎進(jìn)行性別鑒定之前所做的預(yù)試驗(yàn)。在胚胎移植前對胚胎取樣進(jìn)行性別鑒定時(shí)，如果從胚胎取樣的細(xì)胞數(shù)少，PCR靈敏度不夠，擴(kuò)增產(chǎn)物少，鑒定結(jié)果不好判斷;而如果從胚胎取樣的細(xì)胞數(shù)過多，對胚胎的傷害大，影響其妊娠率。因此，在對胚胎進(jìn)行切割取樣時(shí)只需數(shù)個(gè)細(xì)胞就能得到準(zhǔn)確的結(jié)果，降低了對胚胎的傷害，可以提高移植的成功率，為后期對山羊早期胚胎進(jìn)行性別鑒定奠定了基礎(chǔ)。另外，利用PCR技術(shù)還可以提高對家畜致病菌的檢測［12］。

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