肖 雯 ，聶福平 ，王 昱 ，肖進文 ，李應(yīng)國 ，劉 力

（1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶北碚 400715；2.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶江北 400020；3.重慶進出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶江北 400020）

山羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV）包括山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）、綿羊痘病毒（Sheeppox virus，SPV）和牛結(jié)節(jié)疹病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV），屬于痘病毒科（Poxviridae）脊椎動物痘病毒亞科（Chordopoxvirdae），分別引起山羊痘、綿羊痘和牛結(jié)節(jié)疹，感染動物表現(xiàn)為發(fā)熱，皮膚、黏膜、器官表面廣泛性丘疹或結(jié)節(jié)，皮膚水腫，淋巴結(jié)腫大，消瘦，產(chǎn)乳量大幅度降低，嚴重時導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的危害，造成嚴重的經(jīng)濟損失，阻礙國際貿(mào)易[1-2]。山羊痘最早于公元前200年在歐洲發(fā)現(xiàn)，綿羊痘最早于13世紀在英國發(fā)現(xiàn)，山羊痘和綿羊痘統(tǒng)稱羊痘，是動物痘病中最為嚴重的一種，發(fā)病率50%～80%，病死率20%～80%，其中羔羊致死率可達100%。世界各國均有羊痘發(fā)病和流行的相關(guān)報道，目前非洲北部、中東和亞洲的部分國家流行較為嚴重。羊痘病毒可作為生物武器，美國疾病控制中心（CDC）將其劃歸到Ⅱ類危險病毒。此外，中國、印度、瑞典有人感染羊痘病毒的報道，因此羊痘在公共衛(wèi)生方面也有要意義[3]。牛結(jié)節(jié)疹于1929年在贊比亞首次發(fā)生，主要分布在非洲，發(fā)病率3%～85%，死亡率差異很大，一般為1%～2%，但在某些情況下可達20%～85%，近年來，隨著國際貿(mào)易的日益頻繁，該病在非洲以外地區(qū)擴散的趨勢。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將山羊痘、綿羊痘和牛結(jié)節(jié)疹列為法定通報傳染病，我國將山羊痘、綿羊痘列為一類動物疫病[4]。

1 病原學(xué)檢測技術(shù)

1.1 電鏡觀察

CaPV是一種親上皮性的病毒，病畜的皮膚丘疹和結(jié)節(jié)、黏膜、血液、鼻腔分泌物、肺部病損組織和淋巴結(jié)內(nèi)存在大量病毒粒子，可作為病原分離培養(yǎng)的病料標本，切片負染后，直接在透射電鏡下觀察病毒粒子進行診斷。由于羊痘屬三種病毒形態(tài)相似，且與正痘病毒也很難區(qū)別，需要盡可能多觀察以確定病毒形態(tài)。該方法檢出率低，耗時長，發(fā)病區(qū)往往無這樣的專業(yè)設(shè)備，難以滿足快速診斷的需要。

1.2 病毒培養(yǎng)

CaPV可在山羊、綿羊、牛的組織培養(yǎng)細胞上生長，原代或次代羔羊睪丸（LT）細胞和羔羊腎（LK）細胞最為敏感，尤其是毛用綿羊細胞，也可在某些傳代細胞系中增殖，如BHK-21、Vero-E6細胞等[5]。周碧君等[6]研究表明，組織病料對Vero-E6細胞的適應(yīng)性比對BHK-21細胞要好，前者可用于臨床組織樣本中羊痘病毒的初次分離。病毒接種后24 h出現(xiàn)細胞病變，3 d后整個細胞單層出現(xiàn)病變，特征為細胞膜收縮并與周圍細胞分離，圓化，染色質(zhì)貼近細胞膜。病毒分離培養(yǎng)特異性較高，但耗時、費力，需要較高的專業(yè)知識和技能，因而在應(yīng)用上受到限制。

2 血清學(xué)檢測技術(shù)

2.1 中和試驗（neutralization test，NT）

機體感染CaPV后主要產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答，僅產(chǎn)生低水平的中和抗體，因此該方法敏感性不高[7]。但是，感染病毒后痊愈的動物在其血清中可檢測到較高水平的中和抗體。

2.2 熒光抗體試驗（fluorescent antibody test，F(xiàn)AT）

山羊痘病毒抗原可在感染的組織培養(yǎng)破片上進行FAT來鑒定，但該方法操作繁瑣，有非特異性反應(yīng)的問題，難以推廣[7]。

2.3 瓊脂凝膠免疫擴散試驗（agar gel immunodiffusion test，AGID）

AGID最早應(yīng)用于60年代，可用于羊痘病毒沉淀抗原的檢測，后來利用甲硫氨酸對山羊痘抗原進行標記，極大地提高了對山羊痘抗體的檢測敏感性。AGID操作簡單、需要設(shè)備少、價格便宜等特點而得到廣泛應(yīng)用，但其敏感性相對較低，適于基層獸醫(yī)開展山羊痘病例的診斷[8]。

2.4 對流免疫電泳（counter immune electrophoresis，CIE）

CIE是一種常用的檢測抗原或抗體的方法，1988年首次用于檢測羊痘病毒抗體，結(jié)果顯示用滅活的抗原與抗體具有同等的敏感性，與AGP相比，其檢出率更高。1999年，Joshi等用生理鹽水溶液替代巴比妥緩沖液，改進的后CIE與常規(guī)CIE相比，可提高檢測的靈敏度。周碧君等[9]研究發(fā)現(xiàn)CIE能提高對抗原或抗體的分辨能力，較AGID敏感且速度快。該方法比較簡單經(jīng)濟，但需要一定的設(shè)備。

2.5 間接血凝試驗（indirect hemagglutination assay，IHA）

CaPV本身不能凝集紅細胞，因此利用致敏的綿羊紅細胞進行間接凝集實驗非常有用，如反向被動血 凝 試 驗（reversed passive hemagglutination assay，RPHA）主要用于臨床痘疹痂皮和感染細胞中GPV抗原的定量測定。IHA用于實驗室檢測CaPV比AGIDT和CIE更敏感。在各種類型的致敏紅細胞中，用戊二醛與鞣酸致敏可大大提高檢測的靈敏度，在綿羊痘的診斷中效果較好[10]。

2.6 乳膠凝集試驗（latex agglutination test，LAT）

LAT在多種抗體、抗原檢測系統(tǒng)中被廣泛應(yīng)用，是一種不需要昂貴的設(shè)備，操作簡便、快速的檢測方法，特別適合在田間和農(nóng)場使用。1996年，Rao等首次建立了檢測羊痘的乳膠凝集試驗，其敏感性可與CIE相當。

2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）

ELISA操作便利、快速、敏感、特異性強，便于自動化等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。國外已建立了多種檢測CaPV抗原或抗體的ELISA方法。Carn[11]建立了用于檢測從山羊、綿羊、牛的活組織樣品中分離的羊痘病毒的抗原捕捉ELISA方法，適合于組織培養(yǎng)物中的病毒檢測。1997年Rao等[12]建立了用于檢測皮膚活組織中的GPV抗原的免疫捕捉IC-ELISA方法，特異性80%～100%，敏感性70%～86%，該法不能與綿羊痘區(qū)別診斷。1999年Rao等[13]建立了用于檢測GPV抗體的Avidin-biotin（抗生素蛋白-生物素）ELISA方法，特異性為91.8%，敏感性為94.1%。然而，目前國內(nèi)外還暫無牛結(jié)節(jié)疹ELISA檢測方法報道。

P32蛋白抗原在ELISA中反應(yīng)性好，靈敏度、特異性較AGID高，可進行批量樣品的檢測，與國際通用的NT比較，有與其他痘病毒也無交叉反應(yīng)、不需要組織培養(yǎng)條件、檢測樣本量大、便于推廣等優(yōu)點[11-14]，但是，其跨膜區(qū)對細胞有毒性，使其表達量較低，重組P32蛋白很難純化[15]，而截取跨膜區(qū)會對P32蛋白免疫原性有一定影響[16]，因而推廣受到限制。目前，P32蛋白的體外表達已成為國際上羊痘研究的熱點[17-23]。

3 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

隨著聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法的日益成熟，該技術(shù)已廣泛用于病毒的分類、鑒定和疾病診斷。CaPV屬于雙股DNA病毒，更適于PCR檢測[16，23-25]。已報到的羊痘病毒PCR檢測方法中，引物多根據(jù)編碼羊痘衣殼蛋白P32和反向末端重復(fù)序列（Inverted terminal repeat，ITR）設(shè)計。國外Ireland[24]和Heine等[26]根據(jù)P32基因序列設(shè)計了相應(yīng)的引物，建立了檢測皮膚樣品中羊痘病毒的PCR方法，并利用限制性內(nèi)切酶做了進一步的確診。Markoulatos等[25]針對SPV的ITR和α微管蛋白基因設(shè)計3對引物，建立了用于檢測皮膚組織中SPV的多重PCR技術(shù)，該方法敏感性和特異性較好，但偶爾會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。Hosamani等[27]依據(jù)GPV和SPV的P32基因序列的差異，建立了區(qū)分山羊痘和綿羊痘的限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法。在國內(nèi)，郭巍等[28]根據(jù)P32基因和α微管蛋白基因序列設(shè)計2對引物，建立了山羊痘的診斷方法，擴增出P32基因序列與Genbank上收錄的序列同源性達98%。康文玉等[29]依據(jù)羊痘 P32基因序列，建立了快速、特異、敏感、可定量、可同時檢測大量樣品的實時熒光定量PCR技術(shù)。韓若嬋等[30]根據(jù)P32基因和ITR設(shè)計2對引物，建立的多重PCR方法。Stram Y[31]等通過進化樹比對分析羊痘病毒基因組末端466 bp片段，建立的半巢式PCR方法，分別與綿羊痘病毒、羊口瘡病毒和牛皰疹病毒進行PCR比對檢測，該方法檢測羊痘病毒的特異性高。

此外，還有針對CaPV其他基因建立PCR方法的研究。如Mangana Vougiouk等[32]基于山羊痘病毒的KS-1和Ins-1基因序列設(shè)計引物鑒定了6株在細胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)的SPV，能將其與接觸傳染性膿皰皮炎病毒和皰疹病毒區(qū)分開。程振濤等[33]針對山羊痘病毒基因組gp064區(qū)域約64 bp的基因片段設(shè)計一對PCR引物和一條TaqMan-MGB探針，建立了FQPCR和標準曲線，用該方法對山羊痘臨床皮膚痘疹材料和人工感染動物材料進行GaPV核酸檢測，為山羊痘臨床快速高效地診斷和山羊痘病毒感染羊只的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸研究提供了一種有效的手段。Lamien等[34]根據(jù)G蛋白耦聯(lián)趨化因子受體基因建立實時熒光PCR方法，能對羊痘病毒屬進行種屬鑒別、定量分析和基因分型。目前還沒有基因芯片技術(shù)應(yīng)用于羊痘病毒檢測的相關(guān)報道。

4 Western印跡

Western免疫印跡是以山羊痘病毒感染的細胞裂解物檢查血清樣本中病毒結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體，敏感性和特異性較高，但該方法操作困難、價格昂貴[35]。羊傳染性結(jié)節(jié)口炎病毒高免血清可與一些山羊痘病毒蛋白反應(yīng)，但不與P32蛋白反應(yīng)。

5 展望

近年來，我國新疆、甘肅、寧夏、青海、陜西、福建、貴州等地頻繁地發(fā)生山羊痘和綿羊痘疫情，嚴重影響國內(nèi)養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展。我國尚無確切的牛結(jié)節(jié)疹相關(guān)報道，但隨著國際貿(mào)易日益頻繁，近年來該病流行范圍有逐漸擴大的趨勢。為了降低羊痘帶來的巨大經(jīng)濟損失、公共衛(wèi)生安全問題和嚴格防止牛結(jié)節(jié)疹的傳入，建立快速高效、操作簡便、成本低廉的檢測方法具有重要意義。羊痘病毒屬間及其與正痘病毒和副痘病毒有相似的血清型，血清學(xué)方法難以診斷。分子生物學(xué)檢測方法的靈敏度、特異性和時效性等優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法，進一步研究CaPV基因組特異性強的序列、表達量高的功能基因序列，或一些重要的編碼功能的基因，將會為羊痘病毒屬的鑒別診斷、預(yù)防與控制、流行病學(xué)等開辟新的領(lǐng)域。

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