王志新，趙 琳，李文濱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

高等植物的基因表達調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯調(diào)控和翻譯后調(diào)控。其中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是由順式作用元件和反式作用因子相互作用實現(xiàn)的，是表達調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。植物基因的啟動子序列包含多種重要的順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控下游相應(yīng)基因表達，從而使植物能夠適應(yīng)復(fù)雜多變的生長環(huán)境。對植物啟動子的研究有助于了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達模式及其調(diào)控機制，并應(yīng)用于基因工程中提高或改進外源目的基因的表達。

植物啟動子按其轉(zhuǎn)錄方式可以分為：組成型、組織特異型和誘導(dǎo)型啟動子[1]。但不具有絕對性，如絕大部分果實特異性啟動子同時存在乙烯應(yīng)答元件，故也可看作是乙烯誘導(dǎo)型啟動子，所以不同的研究方法和分析角度會對同一啟動子的分類產(chǎn)生差異；同樣，一種類型的啟動子也往往會具有其他類型啟動子的特性。

由于信號刺激而具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動子稱為誘導(dǎo)型啟動子[1]。誘導(dǎo)型啟動子大多具有以下共同特點：（1）啟動子的活化受物理或化學(xué)信號的誘導(dǎo)；（2）具有增強序列、沉默序列或類似功能；（3）感受特異性誘導(dǎo)的序列都有明顯的專一性；（4）部分該類型的啟動子同時具有組織特異性表達的特點[2]。

與組織器官特異性啟動子相比，該類啟動子可以快速有效地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因的“開、關(guān)”，可根據(jù)需要在植物特定發(fā)育階段、組織器官或生長環(huán)境下接受誘導(dǎo)信號，誘導(dǎo)基因表達；也可以隨時解除脅迫，停止表達[2]。這樣不僅不會造成植物體內(nèi)資源的浪費，又可提高植物的抗性。

1 植物誘導(dǎo)型啟動子的種類

誘導(dǎo)型啟動子常以誘導(dǎo)信號命名，可分為光誘導(dǎo)表達基因啟動子、熱誘導(dǎo)表達基因啟動子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達基因啟動子、激素誘導(dǎo)表達基因啟動子、真菌誘導(dǎo)表達基因啟動子等。以下就幾種常見的誘導(dǎo)型啟動子類型加以闡述。

1.1 光誘導(dǎo)啟動子

在高等植物的發(fā)育過程中，光不但直接參與光合作用，而且作為一種重要的信號調(diào)控相關(guān)基因的表達。光調(diào)控基因通常包括與光合作用和光形態(tài)發(fā)生作用有關(guān)的基因，此類基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控大多是通過光誘導(dǎo)型啟動子來實現(xiàn)的。

大量的研究表明，光應(yīng)答啟動子包含著許多正、負調(diào)控元件[2]，但是存在于光應(yīng)答啟動子中的順式元件也存在于其他非光應(yīng)答啟動子中，可能是這些順式元件的特殊組合方式指導(dǎo)光調(diào)控基因的表達，但這種特殊組合方式不是專一的、保守的，沒有哪一種類型的順式元件存在于所有光應(yīng)答啟動子中，也沒有哪一個順式元件能單獨使啟動子具有光應(yīng)答的特性。研究發(fā)現(xiàn)在光調(diào)控基因啟動子區(qū)段往往存在著若干光應(yīng)答元件（light response elements,LREs），如G-box、boxⅠ、boxⅡ、boxⅢ、A/T富含區(qū)和Gap-box等，它們對光調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活是必需的[3]。

G-box是植物通用信號誘導(dǎo)元件，最早從編碼RbcS基因的上游區(qū)鑒定出來。它高度保守，通常含有一個核心序列5'-CACGTG-3'[4]，且必須和其他光反應(yīng)元件相互作用才能起到光調(diào)節(jié)的功能。目前已經(jīng)分離得到了一些G-box結(jié)合蛋白，它們具有bZIP結(jié)構(gòu)。另外研究發(fā)現(xiàn)MYC（myelocytomatosis oncogene）蛋白不僅可以和E-box結(jié)合，也可以和G-box結(jié)合，E-box的序列為5'-CANNTG-3'。boxⅠ又稱GATA元件，含有5'-GATAA-3'序列。一些光應(yīng)答基因中含有單一的GATA元件，但是也有一些含有多個拷貝。GATA元件的缺失或突變都會導(dǎo)致啟動子光應(yīng)答能力的下降。

1.2 傷誘導(dǎo)啟動子

當(dāng)植物受到人為的創(chuàng)傷或害蟲造成的機械損傷后，會產(chǎn)生一些小分子物質(zhì)和多糖，它們作為信號物質(zhì)誘導(dǎo)一系列防御基因的表達。防御基因不僅可以促進傷口的愈合，而且還可以抑制病原菌的侵襲，主要包括幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡萄糖酶等水解酶類、結(jié)構(gòu)蛋白、蛋白酶抑制劑等[5]。研究最早的損傷基因是土豆和西紅柿的蛋白酶抑制劑基因PinⅡ。研究人員將土豆PinⅡ啟動子從-1300～-700缺失，發(fā)現(xiàn)基因活性大大降低，但是仍然具有傷誘導(dǎo)的活性，因此誘導(dǎo)區(qū)域應(yīng)該在啟動子的近端區(qū)域。隨后研究又將-1300～-195區(qū)段與-90CaMV35S啟動子融合，發(fā)現(xiàn)嵌合啟動子具有傷誘導(dǎo)的活性，因此-700～-195區(qū)段控制該基因的傷誘導(dǎo)表達[6]。

1.3 激素誘導(dǎo)啟動子

植物激素調(diào)節(jié)植物細胞的伸長、分裂和分化，并且控制植物體的生長、發(fā)育、休眠、萌發(fā)、生根、開花、結(jié)果以及果實成熟等過程[1]。對植物激素誘導(dǎo)啟動子的研究，有助于進一步了解植物的生長發(fā)育過程中植物激素作用的機制。目前研究較多的有生長素效應(yīng)啟動子、赤霉素效應(yīng)啟動子、脫落酸效應(yīng)啟動子、乙烯效應(yīng)啟動子、水楊酸效應(yīng)啟動子和甲基茉莉酮酸效應(yīng)啟動子等。

1.3.1 生長素誘導(dǎo)啟動子 生長素誘導(dǎo)啟動子含有多個生長素應(yīng)答元件（Aux responsive element），這些元件在不同來源的生長素效應(yīng)基因中具有一定的保守性。有些生長素誘導(dǎo)啟動子中含有5'-TGTCTC-3'序 列 和 與 它 相 似 的 5'-[G/T]GTCCCAT-3'序列，有些生長素誘導(dǎo)啟動子中含有G-box和TGA-box[7]。Wang等[8]分離了煙草內(nèi)源β-1,4-葡聚糖酶 基 因（cellulose）NtCel7上游1470bp DNA序列，將NtCel7啟動子下游與GUS基因融合構(gòu)建植物表達載體轉(zhuǎn)化大豆、番茄和擬南芥。研究發(fā)現(xiàn)，該啟動子在異源植物內(nèi)與生長素誘導(dǎo)有關(guān)，而與赤霉素、蔗糖和乙烯誘導(dǎo)無關(guān)。

1.3.2 赤霉素誘導(dǎo)啟動子 赤霉素（gibberellic acids）在細胞伸長、開花、花色、萌發(fā)時胚乳中大分子儲藏物的運動等方面都有十分重要的作用。目前對赤霉素誘導(dǎo)基因表達的研究主要集中在谷類糊分層中的α-淀粉酶基因的啟動子中。大麥高等電點的α-淀粉酶基因啟動子中，赤霉素應(yīng)答元件至少是由一個嘧啶盒或[C/T]CTTTT[C/T]或TAACA[A/G]A盒和TATCCAC盒組成，這些元件對赤霉素的正常應(yīng)答是必需的，因此把它們通稱為赤霉素應(yīng)答復(fù)合物。大麥低等電點α-淀粉酶基因啟動子中，在嘧啶盒的上游還有一段序列影響赤霉素的應(yīng)答[9]。嘧啶盒、TAACA[A/G]A盒、TATCCA[C/T]盒存在于許多禾谷類α-淀粉酶基因啟動子和其他赤霉素應(yīng)答啟動子中。在一些等電點高的α-淀粉酶基因啟動子中，缺失嘧啶盒并不降低啟動子赤霉素應(yīng)答的活性[10]，但是大麥低等電點α-淀粉酶基因啟動子Amy32b中的嘧啶盒的突變或缺失會大大降低啟動子的赤霉素應(yīng)答效應(yīng)。TATCCAC盒的突變部分影響啟動子的應(yīng)答效應(yīng)，但是TAACAAA盒的突變則導(dǎo)致啟動子的赤霉素應(yīng)答效應(yīng)完全喪失。

1.3.3 脫落酸誘導(dǎo)啟動子 脫落酸（ABA）在植物的胚胎發(fā)育、種子休眠、種子萌發(fā)以及植物對逆境脅迫的反應(yīng)等過程中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用，因此關(guān)于脫落酸啟動子的研究也是植物啟動子研究的熱點和前沿。研究發(fā)現(xiàn)，ABA誘導(dǎo)表達基因啟動子存在一個PyACGTGGC保守序列，該序列在小麥胚胎發(fā)生晚期表達基因E3中首次被確定為ABA應(yīng)答元件[1]，核心序列為A/GCGT。在含有脫落酸應(yīng)答元件的啟動子中，一般都存在G-box結(jié)構(gòu)。研究者推斷啟動子的ABA誘導(dǎo)活性需要兩個ACGT元件或者一個ACGT元件和一個CE元件，但是ACGT元件和一個CE元件的旁側(cè)序列對啟動子的活性也有一定的影響[11]。

1.3.4 水楊酸誘導(dǎo)啟動子 當(dāng)遭遇病原菌浸染的時候，高等植物會在病原菌浸染的部位產(chǎn)生免疫物質(zhì)，這種植物自身的免疫反應(yīng)成為系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance,SAR)。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)SAR的一個重要信號物質(zhì)就是水楊酸（salicylic acid，SA）。無論是內(nèi)源水楊酸濃度的增高還是外源添加水楊酸，不僅能增強植物的抗性，而且還能刺激一系列病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related，PR）的表達。最早的水楊酸誘導(dǎo)元件是在CaMV35S啟動子中發(fā)現(xiàn)的[12]。研究人員在對35S進行缺失分析的時候發(fā)現(xiàn)，用2mmol/L的水楊酸處理轉(zhuǎn)基因煙草時，全長35S啟動子和-90-35S啟動子的轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片中的GUS活性明顯增高，而-46-35S啟動子轉(zhuǎn)基因植株葉片的GUS活性沒有明顯的變化，說明受水楊酸誘導(dǎo)的元件可能在-90到-46之間。隨后他們又將-90到-46區(qū)段缺失的35S啟動子與GUS融合轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草不受水楊酸誘導(dǎo)。隨后研究者猜測-83到-63區(qū)段的激活序列（activation sequence1，as-1）可能應(yīng)答水楊酸的誘導(dǎo)，他們將該區(qū)段與-46-35S啟動子融合并轉(zhuǎn)化煙草，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草受到水楊酸的誘導(dǎo)，因此，水楊酸的應(yīng)答序列就是as-1元件，該元件的核心序列為5'-TGACG-3'[11]。

1.4 溫度誘導(dǎo)啟動子

1.4.1 高溫誘導(dǎo)啟動子 植物與其他真核生物一樣，包含有許多熱激基因。當(dāng)植物暴露在高溫下，植物就會在短時間內(nèi)合成一些特異蛋白，這些蛋白對植物有保護作用。目前已經(jīng)分離得到了許多熱激蛋白基因的啟動子，在這些啟動子中都存在著熱激元件（HSE），一般情況下真核生物熱激元件的序列為5'-[nGAAn][nTTCn]-3'。在植物中，HSE一般位于TATA-box上游，一致序列為5'-aGAAg-3'[14]。此外，植物熱激基因的啟動子中也存在一些富含AT的序列，AT富含區(qū)的長度和位置是多樣的，如果缺失AT富含區(qū)域，就對啟動子的活性有影響。

1.4.2 低溫誘導(dǎo)啟動子 與高溫一樣，低溫對植物也是一種脅迫，當(dāng)寒冷或霜凍到來之時，耐低溫的植物體內(nèi)就會發(fā)生一系列的生理生化變化，這些變化包括蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物組分的改變以及一些新物質(zhì)的合成。目前已經(jīng)分離得到了許多冷誘導(dǎo)基因，并對它們的相應(yīng)啟動子進行了深入的研究。在擬南芥中，存在著眾多與冷誘導(dǎo)有關(guān)的基因，如KIN1，COR15，LTI7848[15]等。研究發(fā)現(xiàn)上述啟動子都含有CCGAC基序，又稱為CRT/DRE元件，參與冷誘導(dǎo)和脫水應(yīng)答[16]。

1.5 生物脅迫型啟動子

當(dāng)植物受到真菌、細菌、病毒等病原微生物浸染時，植物體內(nèi)相關(guān)保護蛋白基因被激活，從而消除有害代謝產(chǎn)物對植物自身的傷害，調(diào)控這類保護蛋白基因表達的啟動子即生物脅迫誘導(dǎo)型啟動子。Zheng等[17]從雜交三倍體白楊基因組DNA中分離得到一個TIP特異啟動子，序列分析發(fā)現(xiàn)，在該啟動子區(qū)段包含多個與植物保衛(wèi)基因激活有關(guān)的順式調(diào)控元件，如GC富含區(qū)段、AT富含區(qū)段和W-box等；據(jù)此推測，該TIP特異啟動子可能是一個病原誘導(dǎo)啟動子且是防御相關(guān)基因表達所必需的。

2 誘導(dǎo)型啟動子的研究方法

與功能基因的研究相比，有關(guān)啟動子功能研究和分析方法的報道要少得多，而且這些報道都是零星地分散在一些文章中。目前，研究啟動子功能的方法主要有瞬間轉(zhuǎn)化分析、轉(zhuǎn)基因植物的穩(wěn)定表達檢測、缺失突變分析、點突變、凝膠阻滯技術(shù)（EMSA）、酵母單雜交技術(shù)等，以及近年來發(fā)展起來的RNA干涉技術(shù)等，對于誘導(dǎo)型啟動子的研究，大多采取以下幾種方法。

2.1 瞬時表達分析

該技術(shù)是將一段啟動子序列與報告基因融合構(gòu)建表達載體，通過基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化植物細胞，通常轉(zhuǎn)化煙草葉盤，并進行GUS組織化學(xué)染色分析檢測。瞬時表達分析是確定一個啟動子是否具有啟動活性最常用的方法，并不能說明啟動子是否具有誘導(dǎo)性。

2.2 轉(zhuǎn)基因植物的穩(wěn)定表達分析

在研究啟動子尤其是誘導(dǎo)型啟動子的功能時，為了獲得準確可靠的結(jié)果，通常采用轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達的方法，即構(gòu)建啟動子與報告基因融合的植物表達載體進行植物遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株，通過分析不同條件下轉(zhuǎn)基因植株中報告基因的表達來判斷啟動子的誘導(dǎo)活性。

2.3 缺失突變分析

在確定某一段DNA序列為啟動子之后，通常通過去除啟動子部分序列來構(gòu)建缺失表達載體，然后進行植物轉(zhuǎn)化，根據(jù)轉(zhuǎn)化植株中報告基因的表達情況分析啟動子的誘導(dǎo)型元件作用序列。Wang等[18]分離了金華中棉（Gossypiun arboretum var.jinhua）光誘導(dǎo)基因cab5'端上游l009bp的調(diào)控序列并構(gòu)建了啟動子全長和197bp、504bp、779bp的缺失體，GUS定量分析表明只有全長的Gacab啟動子具有光誘導(dǎo)和綠色組織特異表達特性，且504bp的啟動子缺失體啟動活性最高。

2.4 點突變分析

構(gòu)建缺失表達載體確定的只是核心調(diào)控序列的大體范圍，為了進一步精確定位其位置可通過堿基突變的方法構(gòu)建突變體來實現(xiàn)?；蛘?，當(dāng)確定一個順式作用元件的核心序列后，也可通過堿基突變的方法確定是哪一個堿基起決定作用。突變時通常遵循堿基顛換的原則，即嘌呤與嘧啶置換。

2.5 凝膠阻滯技術(shù)（EMSA）

凝膠阻滯實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一種簡單快速檢測蛋白質(zhì)與特異DNA序列結(jié)合的技術(shù)，可用于體外研究啟動子與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況，以確定啟動子的核心順式作用元件[19]。EMSA的原理為：當(dāng)DNA片段結(jié)合蛋白質(zhì)之后分子量增大，其在電場作用下的遷移速率將遠遠小于未結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA分子。因此，可以將雙鏈DNA片段的一端用同位素或地高辛標記，再與蛋白質(zhì)提取物混合，再將混合物電泳，如果目的DNA與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，則其向陽極移動的速度受到阻滯，通過放射性自顯影技術(shù)，就可找到DNA結(jié)合蛋白的樣品。

2.6 酵母單雜交技術(shù)

酵母單雜交技術(shù)（yeast one-hybrid）是1993年由Li等[20]在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上建立的，是一項分析DNA與蛋白質(zhì)尤其是啟動子與轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用的重要技術(shù)。酵母CAL4蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）可激活酵母半乳糖苷酶基因的上游激活位點，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFⅡD相互作用，BD和AD在結(jié)構(gòu)和功能上是相對獨立的。當(dāng)將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼序列用特異的DNA序列取代時，其編碼產(chǎn)物能與目的DNA相互作用。這樣仍可通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。進行酵母單雜交實驗時，先將含有目的啟動子序列和報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細胞，再將文庫cDNA片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建cDNA文庫質(zhì)粒并重復(fù)轉(zhuǎn)化同一酵母細胞，最后根據(jù)下游報告基因的表達情況分析與啟動子相互作用的蛋白。

3 誘導(dǎo)型啟動子的研究展望

由于誘導(dǎo)型啟動子能夠有效地調(diào)控下游基因的表達，最大限度地減少由于外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的積累對其自身造成的傷害，因而得到廣泛的研究。Kasuga等[21]將rd29A::DREB1A和35S::DREB1A轉(zhuǎn)化煙草，與rd29A::DREB1A轉(zhuǎn)基因植株相比，35S::DREB1A轉(zhuǎn)基因煙草明顯出現(xiàn)生長滯后現(xiàn)象；rd29A::DREB1A轉(zhuǎn)基因植株的脅迫耐性也明顯高于35S::DREB1A轉(zhuǎn)基因植株。Pellegrineschi等[22]用脅迫誘導(dǎo)型啟動子rd29A驅(qū)動DREB1A/CBF3的表達，提高了轉(zhuǎn)基因小麥對干旱脅迫的耐性，而且沒有引起明顯的畸形。因此，利用逆境誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動抗逆基因在改良作物的抗性中成為目前研究的熱點。然而，目前能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動子仍然很少。因此，對于新的誘導(dǎo)型啟動子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是今后啟動子研究的重點。

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