劉 飛

(河南省人民醫(yī)院，鄭州450000)

EB病毒(EBV)是傳染性單核細(xì)胞增多癥的致病原，屬于嗜 B 淋巴細(xì)胞病毒屬成員［1，2］。研究顯示，EBV與人類多種惡性腫瘤相關(guān)，其中與鼻咽癌密切相關(guān)［3，4］。鼻咽癌患者外周血EBV DNA水平，與病灶的殘留、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、評(píng)價(jià)療效以及患者的預(yù)后均顯著相關(guān)，但EBV DNA是如何進(jìn)入血液循環(huán)的，目前尚不清楚。2008年12月～2010年12月，我們觀察了鼻咽癌患者外周血EBV DNA水平與癌組織細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，為闡明外周血EBV DNA的來(lái)源提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 鼻咽癌22例，男14例，女8例;年齡28～62歲，平均37.5歲;均行手術(shù)治療，術(shù)中留取癌組織，病理確診為鼻咽低分化鱗癌;患者術(shù)前均未行放化療。

1.2 外周血EBV DNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。采集鼻咽癌患者外周靜脈血0.5～1 ml，EDTA抗凝;1 500 g離心10 min，吸取上層血漿;按照DNA提取試劑盒說明操作，提取的DNA加入50 ml TE緩沖液(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)，置－20℃冰箱保存，用ABI7900熒光定量PCR儀檢測(cè)EBV DNA表達(dá)。EBV DNA:上游引物為5'-TCTCTGCCTCCAGGCAAG-3'，下 游 引 物 為 5'-AGAGGGCCTGTCCACCGT-3'。反應(yīng)條件:95℃ 5 s，58℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)。陽(yáng)性定量參考品為EBV DNA的BamHI-W片段，陰性對(duì)照為陰性質(zhì)控品，均由試劑盒提供。

1.3 鼻咽癌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取術(shù)中分離的鼻咽癌組織，用0.1%膠原酶消化制成單細(xì)胞懸液;冰上操作，500 ml PBS緩沖液懸浮細(xì)胞;按照試劑盒說明加入 Annexin V 和 PI各50 μl，反應(yīng) 30 min;上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，讀取細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本組患者外周血EBV DNA檢出率為86.5%(19/22)、中位數(shù)為2 200拷貝/μl，癌組織細(xì)胞凋亡率為33.27%±13.46%;EBV DNA陽(yáng)性鼻咽癌患者癌細(xì)胞凋亡率為35.93%±12.42%，EBV DNA陰性患者為16.47%±4.83%，兩者比較，P ＜0.05;相關(guān)分析顯示，鼻咽癌患者外周血EBV DNA拷貝數(shù)與癌細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.517，P ＜0.01)。

3 討論

鼻咽癌在國(guó)外發(fā)病率不到1/10萬(wàn)，但在我國(guó)華南地區(qū)甚至可達(dá)30/10萬(wàn)［5，6］。EBV是一種在自然界普遍存在的雙鏈DNA病毒，人群感染率約在90%以上。鼻咽癌是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與EBV感染有關(guān)的人類惡性腫瘤。研究表明，EBV可作為鼻咽癌的腫瘤標(biāo)志物，并在鼻咽癌的早期篩查、診斷，腫瘤分化程度、療效和預(yù)后評(píng)估以及腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等方面都有著重要意義［3，4］，但 EBV DNA 是通過何種途徑進(jìn)入患者的血液循環(huán)目前并不清楚。其可以是病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)繁殖后釋放入血，也可以是腫瘤細(xì)胞凋亡后釋放到血。

外周血EBV感染檢測(cè)的方法有很多種，例如EBV-VCA-IgA ELISA法;但其敏感性和特異性都受到限制，且其主要反映的是機(jī)體對(duì)EBV的免疫功能，并不能完全反映體內(nèi)病毒的表達(dá)豐度［7］。因此，我們選用熒光定量PCR法，其不僅可精確定量病毒的拷貝數(shù)，更能準(zhǔn)確反應(yīng)體內(nèi)病毒表達(dá)的變化。細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法有DNA裂解帶、凋亡小體、dUTP原位切口末端標(biāo)記、磷酯酰絲氨酸(PS)外翻、凋亡相關(guān)因子活性等，其中Annexin V/PI雙染法是一種特異且敏感的凋亡檢測(cè)方法，通過流式細(xì)胞儀可對(duì)凋亡細(xì)胞的比例精確定量［8］。本研究使用上述兩種精確定量方法檢出86.5%的鼻咽癌患者外周血中存在EBV DNA表達(dá)，腫瘤細(xì)胞中存在細(xì)胞的自發(fā)性凋亡;EBV DNA陽(yáng)性患者癌細(xì)胞凋亡率為35.93%±12.42%，而 EBV DNA 陰性者為 16.47%±4.83%;且相關(guān)分析顯示，鼻咽癌患者外周血EBV DNA拷貝數(shù)與癌細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.517，P ＜0.01)。由此可見，鼻咽癌患者血液循環(huán)中的EBV可能來(lái)源于腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞。

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