楊俊杰 ，李 石 ，李 劼 ，呂新剛

（1.兵團(tuán)農(nóng)九師畜牧科學(xué)研究所，新疆額敏 834601；2.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003）

豬支原體肺炎（Mps）亦稱豬氣喘病、豬地方性流行性肺炎，是由豬肺炎支原體（Mhp）感染引起的一種慢性呼吸道傳染病，通常引起豬群生產(chǎn)性能顯著下降，受感染豬群日增重下降、飼料報(bào)酬降低等，給豬場造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

為了解新疆北疆部分規(guī)模豬場中Mhp的感染情況，降低該病對養(yǎng)豬業(yè)的危害，對13個(gè)規(guī)模豬場進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，現(xiàn)將調(diào)查結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 采于北疆地區(qū)13個(gè)規(guī)模豬場，血清364份，病變肺臟72份。

1.1.2 檢測試劑與儀器 豬肺炎支原體（Mhp）抗體檢測ELISA試劑盒購于北京IDEXX；10×Buffer，dNTPs，Taq 酶，DNAMarker，PCR 儀 （Techentc512），酶標(biāo)儀（Biotek）等。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查 2010年11月—2011年5月，對北疆13個(gè)規(guī)模豬場進(jìn)行現(xiàn)場調(diào)查和問卷調(diào)查，調(diào)查豬支原體肺炎在豬場的流行情況，包括發(fā)病的數(shù)量、年齡、病死率、發(fā)病季節(jié)、傳染源、傳播途徑、誘發(fā)因素以及主要臨床癥狀等內(nèi)容，掌握豬支原體肺炎流行的基本情況。

1.2.2 樣品采集 無菌采集13個(gè)規(guī)模豬場不同年齡段的豬血（均未接種過豬肺炎支原體疫苗），待凝固后，4000r/min離心10min，-20℃保存。

剖檢可疑病豬，觀察心、肺、脾等組織病理變化。按參考文獻(xiàn)[2]方法無菌采集肺臟、脾臟等病料，-20℃保存；另取病變肺臟浸泡于10%甲醛溶液中。

1.2.3 Mhp血清學(xué)檢測 按試劑盒說明書操作。

1.2.4 病變組織PCR檢測 DNA的提取參照文獻(xiàn)提取[3]。陽性對照為南京天邦生物科技有限公司生產(chǎn)的豬支原體肺炎活疫苗（168株）。

PCR引物參考文獻(xiàn)[4]合成1對Mhpldh引物，上游引物 p1 為：5'-CCGTTGAAGCCTTGCTGTAT-3'，下游引物 p2 為：5'-CGGTTAGTGTCTCCCGTTATG-3'，擴(kuò)增片段大小為287bp。引物由上海申工公司合成。

PCR 體系 （25 μL）：10×Buffer3 μL，10mM dNTPs0.6μL，上下引物各 1μL，模板 2μL，Taq酶0.3μL，補(bǔ)ddH2O至25μL。設(shè)定以下參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30S，54℃退火30S，72℃延伸40S，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 病理組織學(xué)觀察 將通過PCR鑒定為陽性的肺臟組織，做病理切片。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果 規(guī)模豬場中Mps主要發(fā)生于秋冬季，各年齡段豬勻易感，發(fā)病率高（30%~90%），死亡率低（8%~20%），仔豬發(fā)病后死亡率高。

病豬和帶菌豬是主要傳染源，感染母豬垂直傳染給小豬，豬群間主要通過接觸傳染。

臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、氣喘，明顯的腹式呼吸，精神沉郁，食欲減退，生長發(fā)育停滯，日漸消瘦，被毛粗亂，混合感染其它病原時(shí)常出現(xiàn)體溫升高。以慢性病例多見，病程長達(dá)數(shù)月。使用藥物治療只能減輕臨床癥狀，停藥后很快復(fù)發(fā)。寒冷、潮濕、擁擠的環(huán)境會加劇本病的發(fā)生。

2.2 病理剖檢結(jié)果 病肺呈現(xiàn)大面積肺炎以及不同程度的氣腫；尖葉、心葉呈對稱性實(shí)變，實(shí)變區(qū)大小不一，呈“肉樣變”或“胰變”，硬度增強(qiáng)，病灶與非病變區(qū)有明顯的界限（圖1）。肺門淋巴結(jié)腫大、質(zhì)硬，斷面灰白色，呈髓樣變。

2.3 Mhp血清抗體檢測結(jié)果

2.3.1 各豬場血清抗體檢測結(jié)果 Mhp抗體檢測結(jié)果見表1

表1 Mhp抗體檢測結(jié)果

結(jié)果顯示：364份血清抗體陽性率為52.2%，13個(gè)規(guī)模豬場中陽性豬場有9個(gè)，豬場陽性率為69.23%；陽性率最高的豬場感染率達(dá)90%，說明部分規(guī)模豬場肺炎支原體感染情況比較普遍，個(gè)體感染情況比較嚴(yán)重。

2.3.2 不同年齡段Mhp抗體檢測結(jié)果（見表2）

表2 不同年齡段Mhp抗體檢測結(jié)果

由表2可知，不同年齡段豬Mhp的感染率不同，母豬感染率高達(dá)100%，仔豬感染率相對較低。原因可能是母豬呈隱性感染帶菌或感染耐過后母豬在2~4胎后仍可攜帶此菌，哺育期仔豬與帶菌母豬接觸而被感染，此時(shí)仔豬從母乳獲得了母源抗體的保護(hù)，但母源抗體不能保證新生仔豬免受感染。母源抗體從30天開始衰減，感染仔豬血清抗體逐漸轉(zhuǎn)陽[5]；即使仔豬未被感染，在斷奶混群后如果與病豬和帶菌豬接觸也易被感染，豬感染肺炎支原體后需2~4周才能檢測到抗體；因此育肥豬和母豬陽性率高于仔豬。

2.4 組織PCR檢測結(jié)果 72份病變肺臟進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果42份陽性，陽性率為58.33%，陽性率高于血清學(xué)檢測結(jié)果。部分病變肺臟PCR檢測結(jié)果見圖2。

2.5 病理組織學(xué)觀察 肺支氣管內(nèi)有淋巴樣細(xì)胞浸潤，夾雜有單核細(xì)胞，中性粒細(xì)胞及脫落的肺泡上皮細(xì)胞（圖3），支氣管周圍淋巴樣細(xì)胞增生（圖4），從而使肺泡之間的間隙增厚。

3 討論

豬支原體肺炎是豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）的重要病原之一，廣泛分布于世界各地，其死亡率雖然不高，但由于流行的廣泛性、長期性和消耗性，可使飼料轉(zhuǎn)化率降低，并引起豬的多種并發(fā)病，是造成養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最重要的疾病之一[6]。常呈隱性發(fā)病，多取慢性經(jīng)過，一旦感染，便難以消除。

血清學(xué)診斷雖然可以檢測出Mhp抗體的存在，作為診斷是否感染肺炎支原體的依據(jù)，但并沒有直接檢測其病原，由于個(gè)體血清轉(zhuǎn)陽時(shí)間差異較大，因此僅僅依靠血清學(xué)診斷來確診其感染支原體還不夠。

利用PCR方法進(jìn)行豬肺炎支原體的檢測，為確定豬感染率提供了更加精確的方法[7]。本試驗(yàn)用于PCR檢測病變肺臟的Mhpldh（乳酸脫氫酶）引物，具有種特異性，能與其它種類的支原體（如豬鼻支原體）相區(qū)分[8]，進(jìn)一步提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，血清學(xué)方法和PCR方法結(jié)合可得到滿意的診斷結(jié)果。

本研究首次系統(tǒng)地進(jìn)行了新疆北疆部分規(guī)模豬場Mhp的流行病學(xué)調(diào)查，初步查明了Mhp的感染情況和流行規(guī)律，為該病的診斷和制定有效防控措施提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]周緒斌，DanielT，李聰，等.規(guī)?；i場肺炎支原體血清學(xué)動態(tài)監(jiān)測與啟示[J].豬業(yè)科學(xué)，2008（8）：90-94.

[2]農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局.NY/T541-2002動物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002.

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[4]薛云，趙戰(zhàn)勤，陳楊，等.多重PCR方法快速檢測豬的5種呼吸道病原菌[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，40（8）：1222-1228.

[5]嵇辛勤，段志強(qiáng)，華再東，等.香豬場肺炎支原體的血清學(xué)調(diào)查與分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（9）：92-93.

[6]李彥明，張映.豬肺炎支原體及其生物學(xué)研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003，24（3）：25-27.

[7]Marina Sibila，Maria Pieters，Thomas Molitor，etal.有關(guān)豬肺炎支原體感染診斷方法和流行病學(xué)的最新觀點(diǎn)[J].沈權(quán)，譯.國外畜牧學(xué) -豬與禽，2009，29（3）：4-10.

[8]Caron J，Ouardani M，Dea S.Diagnosis and differentiation ofmycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis infectionin pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes [J].JClin Microbiol，2000，38（4）：1390-1396.