肖 妍，董志珍，欒慎順，陳本龍

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津 300461）

羊癢病（scrapie）是傳染性海綿狀腦?。═SE）的原型，是由羊癢病朊病毒引起成年綿羊和山羊的一種慢性進(jìn)行性的、致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，能引起綿羊和山羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退化變性，病羊具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性、空泡化、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生等特點(diǎn)，瘙癢是癢病的一個(gè)顯著特征，此外， 共濟(jì)失調(diào)、麻痹、衰弱、震顫、姿勢不穩(wěn)、癡呆、知覺過敏、行為異常等神經(jīng)癥狀也是其主要的臨床癥狀，死亡率達(dá)100%[1-3]。

羊癢病可通過病羊的肉骨粉等傳染給牛，而使牛感染為瘋牛病。人食用了被瘋牛病病原污染的食品，可感染上傳染性海綿狀腦病—新變異型克雅氏?。磏vCJD）。因此，羊癢病的診斷是根除和控制瘋牛病、克雅氏病的關(guān)鍵。而到目前為止，在檢測瘋牛病和羊癢病等方面開發(fā)出的免疫組織化學(xué)方法、免疫轉(zhuǎn)印方法、組織印記法、ELISA方法、western-blot等方法均為死后診斷和確診法，不利于本病的控制和根除[4-5]。

引起羊癢病的病原是一種無核酸的蛋白質(zhì)侵染顆粒朊蛋白（Prion protein， PrP），是由宿主神經(jīng)細(xì)胞表面正常的一種唾液酸糖蛋白（PrPc）在三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后形成的異常蛋白（PrPsc），由于英國“瘋牛病”的發(fā)生使得此蛋白備受研究人員的關(guān)注[6-7]。

研究表明， 羊癢病的發(fā)生與綿羊朊蛋白編碼基因PRNP遺傳多樣性密切相關(guān)，主要表現(xiàn)在綿羊PRNP第136、154和171位密碼子組成的PRNP基因型與綿羊?qū)ΠW病的抗病性相關(guān)[8-10]?；加蠺SE的病羊其基因組中的三個(gè)等位基因發(fā)生了突變，即136位點(diǎn)上的A突變成了V、154位點(diǎn)上的R基因突變成了H基因，171位點(diǎn)上的Q基因突變成了R或H，研究表明野生基因型ARR/ARR或ARR/ARQ是抗性基因型，具有此基因型的羊基本上不會(huì)感染TSE，而ARQ/ARQ、VRQ/ARQ、AHQ/VRH等其它基因型羊則為敏感型，易患TSE[11-13]。也有研究稱含有雜合子VRQ/ARR基因型的羊感染了羊癢病，但是當(dāng)有ARR等位基因和非VRQ等位基因伴隨時(shí)，羊很少有感染羊癢病的報(bào)道。本研究旨在利用已建立的利用熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）快速分析的方法對羊癢病抗性基因進(jìn)行篩選，對我國部分地區(qū)的羊癢病基因型分布情況進(jìn)行調(diào)查，從而從品種選育水平上杜絕羊癢病的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

各型綿羊PRNP基因標(biāo)準(zhǔn)品由意大利Institut zooprofi lattic sperimen DELLA SARDEGNA 惠贈(zèng) ；基因擴(kuò)增預(yù)混液Taqman Universal PCR MasterMix購于Applied Biosystems試劑公司；基因組DNA提取試劑盒購于TIANGEN試劑公司。

1.2 綿羊基因組DNA的提取

按照TIANGEN血液基因組 DNA提取試劑盒說明提取。

1.3 熒光定量PCR檢測

選 取 20 μL PCR 反 應(yīng) 體 系 ：2×mastermix：10μL；DNA：2 μL；上游引物（10 μM）：2 μL；下游引物（10 μM）：2 μL；FAM標(biāo)記的探針（10 μM）：0.5μL；VIC 標(biāo)記的探針（10 μM）：0.5 μL；雙蒸水補(bǔ)齊至 20 μL。

樣品放入Roche LightCycler 480熒光定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行檢測，其實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序如下 ：50 ℃ 2 min ；95 ℃ 10 min ；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共35~40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)延伸末期采集數(shù)據(jù)。

反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行終點(diǎn)讀板分型，選擇標(biāo)記探針的兩種檢測信號(hào)FAM和VIC，程序如下：61 ℃預(yù)熱1 s，60 ℃連續(xù)讀板，同時(shí)收集5個(gè)信號(hào)。

機(jī)器將根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)將兩種熒光信號(hào)進(jìn)行比較計(jì)算，自動(dòng)分型。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的擴(kuò)增

采用終點(diǎn)讀板基因分型模式（Endpoint Genotyping）檢測483~533 nm通道（FAM）和523~568 nm通道（VIC）的數(shù)據(jù)，經(jīng)過計(jì)算比較二者的比值，得到基因分型散點(diǎn)圖（見圖1）。各標(biāo)準(zhǔn)品均按其基因型表現(xiàn)為純合子（136AA、136VV、154RR、154HH、171RR、171HH、171QQ）及雜合子（136VA、154RH、171RH、171RQ和171HQ），說明引物及探針設(shè)計(jì)的特異性完全能夠用于SNP快速分析。

2.2 樣本檢測結(jié)果

表 1 樣本檢測結(jié)果

基因型分布情況見圖2~7。

3 討論

綿羊的基因型與發(fā)生羊癢病有著重要的關(guān)系，如表1所列[14]。

不同PrP基因型對羊癢病的敏感性不同，因此篩選出對TSE有抗性的羊群是控制和根除本病的關(guān)鍵，目前的科學(xué)研究表明野生基因型ARR/ARR或ARR/ARQ是抗性基因型，具有此基因型的羊基本上不會(huì)感染TSE，而ARQ/ARQ、VRQ/ARQ、AHQ/VRH等其它基因型羊則為敏感型，易患TSE，因此可根據(jù)朊蛋白的基因型而采取相應(yīng)的措施和計(jì)劃來控制羊癢病、瘋牛病等。

表 2 綿羊PrP基因型與羊癢病發(fā)生的危險(xiǎn)性

經(jīng)過我們對北京、天津、新疆、云南4個(gè)地區(qū)的254份無角多賽特綿羊血液樣本進(jìn)行基因分型試驗(yàn)，結(jié)果表明，ARR/ARR或ARR/ARQ抗性基因型所占比例為44%；基因型ARR/ARH 所占比例為9%，此基因型對羊癢病有抗性，但育種時(shí)要選育；對于羊癢病有高易感性的基因型ARQ/VRQ所占比例為4%，其中新疆所檢74份樣品中未檢出，北京100份樣品中檢出9份，比例為9%，天津和云南所檢40份樣品中各檢出1份，比例為2.5%。

對于羊癢病有較高易感性的基因型ARQ/ARQ，ARH/ARQ，ARH/ARH，ARH/AHQ，ARQ/AHQ，AHQ/AHQ所占比例分別為27%，10%，3%，1%，2%和0.4%，由此可見，我國以上四個(gè)地區(qū)的無角多賽特綿羊PrP基因型的分析可知，我國飼養(yǎng)的綿羊抗性基因型的比列占到了53%，一半以上的綿羊具有羊癢病抗性，可以用于育種和基因篩選；對于羊癢病有高易感性的基因型ARQ/VRQ所占比例為4%，對于此基因型的綿羊不能用于育種，應(yīng)將羔羊宰殺或閻割；對于羊癢病有較高易感性的基因型占到了43%，對于此類型的綿羊?qū)ρ虬W病有較小的抗性，可以賣掉或在某一階段用于育種。

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