錢學(xué)智

（江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，泰州 225300）

雞球蟲病是一種由孢子蟲綱真球蟲目艾美耳科艾美耳屬（Eimeria）的球蟲引起的寄生性原蟲病，呈世界性分布，世界上凡是養(yǎng)雞的地方就有雞球蟲存在。該病是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞生產(chǎn)的主要雞病之一。據(jù)統(tǒng)計，在各種雞病中，球蟲病的發(fā)生率最高，占1/6～1/5。15～50日齡的雛雞發(fā)病率最高，死亡率可高達(dá)80%。成年雞多為帶蟲者，增重和產(chǎn)蛋受到一定影響。耐過的病雞，長期不得康復(fù)，生長發(fā)育受到嚴(yán)重的影響。而且，球蟲寄生引起的組織損傷和腸道功能的變化，可造成各種有害病菌的侵入和繁殖，如產(chǎn)氣莢膜梭狀桿菌（Clostridium perfringens），可導(dǎo)致壞死性腸炎或傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimunium）的繼發(fā)感染。球蟲病還可與免疫抑制性疾病如馬立克氏?。∕D）和傳染性法氏囊?。↖BD）等并發(fā)[1]。

球蟲病對養(yǎng)雞業(yè)造成的危害：一方面，爆發(fā)后大批的死亡和生產(chǎn)力的下降，另一方面，在于預(yù)防給藥所需的巨大費用。從世界范圍看，估計全世界每年因雞球蟲病造成的損失高達(dá)20億美元，全球每年用于防治雞球蟲病的藥物費用約20英鎊。就國內(nèi)而言，據(jù)報道近年來我國的雞存欄數(shù)約30億羽左右，按每羽支付抗球蟲藥費用至少0.1～0.2元計算，則全年用于防治雞球蟲病的費用可達(dá)3.1億～6.2億元人民幣，實際發(fā)生的費用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高得多。

雞球蟲同一宿主可以感染幾種球蟲，而且不同的地理區(qū)域球蟲種類的分布和優(yōu)勢種有所不同。不同種類的球蟲其致病性有很大的差異，因而了解不同地理區(qū)域和不同雞場球蟲種類的分布對于雞球蟲病的預(yù)防具有指導(dǎo)意義。江蘇省海安縣是中國著名的禽蛋之鄉(xiāng)，雞的養(yǎng)殖數(shù)量和規(guī)模在國內(nèi)處于領(lǐng)先地位，雞的球蟲病一直是困擾該地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)的一大主要疾病。為了對臨床用藥提供一定的理論依據(jù)，我們選擇了海安鎮(zhèn)周邊地區(qū)具有一定代表性的某規(guī)?；怆u飼養(yǎng)場，對其雞球蟲種類及感染情況做了一初步調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

糞便采集于海安縣海安鎮(zhèn)某大型AA肉雞飼養(yǎng)場，該雞場為網(wǎng)上平養(yǎng)，多年受到雞球蟲病的困擾，采樣時該雞場飼養(yǎng)3批（45日齡、50日齡和55日齡）肉雞，對3批肉雞各選擇2棟雞舍進(jìn)行采樣，每棟雞舍采樣時分四周和中央共5點，采集新鮮排出的糞便，迅速送回江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院寄生蟲實驗室進(jìn)行處理。

1.2 卵囊分離培養(yǎng)

將糞樣分別置于干凈的小燒杯中，再加入適量的清水?dāng)嚢杌靹?，分別經(jīng)60目銅絲篩和260目尼龍篩過濾，倒去糞渣，將濾液按照水洗沉淀法反復(fù)洗滌，傾棄全部上清液得沉渣。將沉渣加入飽和鹽水并移入離心管使之近滿，攪動管底沉渣，靜置3～5 min后，再在2 000 r/min條件下離心5 min，沉渣中卵囊即漂浮至液面。吸取上層飽和鹽水，加清水進(jìn)行反復(fù)水洗離心沉淀，沉淀即為已經(jīng)初步純化的球蟲卵囊。沉淀中最后加入等量的25 g/L重鉻酸鉀，移至加蓋的平皿中，放入29℃的恒溫箱中培養(yǎng)，經(jīng)?；蝿?，使有充分的氧氣孢子化，并視情況滴加25 g/L重鉻酸鉀防止干涸，培養(yǎng)3～5 d使之孢子化，并進(jìn)行種類鑒定。

1.3 球蟲種類鑒定

將含分離卵囊的培養(yǎng)皿置于29℃溫箱后，每間隔一段時間用吸管吹打混勻培養(yǎng)液并吸取1滴置于帶有測微尺的顯微鏡下，在10×40倍下觀察每一種孢子化卵囊的形態(tài)、顏色、大小、卵囊壁的厚度與光滑度、卵膜孔、極粒、內(nèi)外殘體的有無、孢子囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)、孢子囊和子孢子的大小以及出現(xiàn)時間，顯微測量每種卵囊大小至少觀察50個，計算其平均值和形狀指數(shù)。同時隨機(jī)觀察100個孢子化卵囊，記錄每種卵囊所占比例。最后根據(jù)觀察和統(tǒng)計結(jié)果并參照圖譜和有關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行蟲種鑒定[1]。

1.4 分離

1.4.1 試驗動物

1日齡健康剛出殼蘇禽黃羽肉雞，購自江蘇揚州中國農(nóng)科院家禽研究所育種中心，飼養(yǎng)于無球蟲的環(huán)境中，自由采食和飲水，所喂飼料在加工配制過程中保證不含有任何抗球蟲藥，水經(jīng)煮沸10 min以上冷卻后供雞飲用。雛雞飼養(yǎng)至12日齡，經(jīng)過糞便飽和鹽水漂浮鏡檢無球蟲后進(jìn)行卵囊接種增殖試驗。

1.4.2 卵囊接種與柔嫩艾美爾球蟲的初步分離

將1.2中3批雞分離的孢子化的卵囊混勻后按每只雞1萬個用鈍頭注射器經(jīng)口接種于12日齡的肉雞，第8～9 d撲殺，取盲腸內(nèi)容物，按照1.2中糞樣中卵囊分離的方法和步驟分離培養(yǎng)卵囊。將分離的孢子化卵囊再次接種12日齡的肉雞，第8～9 d撲殺，取盲腸內(nèi)容物，同時收集6～8 d糞便，按照1.2中糞樣中卵囊分離的方法和步驟分離培養(yǎng)卵囊，進(jìn)行卵囊的復(fù)壯和增殖，以備藥物療效試驗時接種用。

2 結(jié)果

2.1 球蟲種類調(diào)查結(jié)果

經(jīng)過調(diào)查，該肉雞飼養(yǎng)場主要感染3種雞艾美耳球蟲，即柔嫩艾美耳球蟲（E. tenella）、巨形艾美耳球蟲（E. maxima）和堆形艾美耳球蟲（E. acervulina），3種日齡的肉雞感染的種類則完全一致，說明該雞場球蟲感染種類較為一致和恒定，所觀察到的3種球蟲特征如下：

2.1.1 柔嫩艾美耳球蟲

卵囊寬卵圓形，卵囊壁兩層，光滑無色；卵囊大小為（19.5～26 μm）×（15.7～21.6）μm，平均為22 μm×19 μm，形狀指數(shù)1.16；無卵膜孔；無卵囊殘體；有1～2個極粒；孢子囊呈橢圓形，大小為（12～13 μm）×（4.5～7.5）μm，平均為12.2μm×6μm，有孢子囊殘體，有斯氏體；子孢子大小為（9～10 μm）×（1.5～2）μm。

2.1.2 巨型艾美耳球蟲

卵囊卵圓形，是6種球蟲中最大的，卵囊壁2層，粗糙淺黃色，在重鉻酸鉀溶液中略帶藍(lán)色；卵囊大小為（21.5～42.5）μm×（16.5～29.8）μm，平均為30.5 μm×20.7 μm，形狀指數(shù)為1.47；有卵膜孔；無卵囊殘體；有1極粒；孢子囊長卵圓形，大小為（15～19）μm×（8～9）μm，平均為18μm×9μm，無孢子囊殘體，有斯氏體，折光體明顯；子孢子大小為19 μm×4 μm。

2.1.3 堆形艾美耳球蟲

卵囊窄卵圓形，一端較尖，卵囊壁2層，窄端內(nèi)膜變薄，無色光滑；卵囊大小為（17.7～20.2）μm×（13.7～16.3）μm，平均為18.3 μm×14.6 μm，形狀指數(shù)為1.25；無卵膜孔；無卵囊殘體；有1極粒；孢子囊長卵圓形，大小為（9～12 μm）×（4.5～7.5）μm，平均為10.5 μm×5.5 μm，無孢子囊殘體，有斯氏體。

2.2 3種球蟲感染情況

在顯微鏡（400×）下對3種日齡肉雞所采集糞便中分離的球蟲孢子化卵囊進(jìn)行觀察，每個樣品分別連續(xù)觀察100個孢子化卵囊，統(tǒng)計出3種球蟲所占所觀察球蟲總數(shù)的百分比，結(jié)果詳見表1。

表1 3種球蟲卵囊占卵囊總數(shù)的百分比（%）

由表中可知，3種日齡雞感染的3種球蟲的百分比雖然有一定的差異，但是基本一致。45日齡雞感染柔嫩艾美耳球蟲比例最高，為65%，其次為巨型艾美耳球蟲，為22%，堆形艾美耳球蟲最低，為13%。50日齡雞感染柔嫩艾美耳球蟲比例最高，為71%，其次為巨型艾美耳球蟲，為18%，堆形艾美耳球蟲最低，為11%。55日齡雞感染柔嫩艾美耳球蟲比例最高，為78%，其次為巨型艾美耳球蟲，為14%，堆形艾美耳球蟲最低，為12%。綜合來看，該肉雞飼養(yǎng)場以柔嫩艾美耳球蟲所占比例最高，為優(yōu)勢蟲種，其次為巨型艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲，這兩種球蟲所占的比例較低。

2.3 柔嫩艾美爾球蟲的初步分離結(jié)果

將初步分離的孢子化的混勻卵囊后接種于12日齡的肉雞后，未出現(xiàn)明顯血糞，剖檢盲腸，盲腸壁可見輕微出血，將盲腸壁及內(nèi)容物中的卵囊分離后進(jìn)行孢子化，鏡檢確定均為柔嫩艾美爾球蟲。將分離的柔嫩艾美爾球蟲再次接種12日齡肉雞，4 d時開始出現(xiàn)血糞，8 d撲殺時候，盲腸腫大，形成血凝塊和壞死組織混合在一起的腸栓，盲腸壁出血和壞死嚴(yán)重，盲腸壁及內(nèi)容物中的卵囊分離后進(jìn)行孢子化，鏡檢確定均為柔嫩艾美爾球蟲，柔嫩艾美爾球蟲初步分離和復(fù)壯獲得成功。

3 小結(jié)與討論

（1）目前，全世界公認(rèn)的雞艾美耳球蟲有7種，即柔嫩艾美耳球蟲、堆形艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲和和緩艾美耳球蟲。另外，還有2種即哈氏艾美耳球蟲和變位艾美耳球蟲，其分類地位一直未得到公認(rèn)。本次調(diào)查共檢出3種，此次對球蟲卵囊的鑒定主要以孢子化卵囊特征為主要依據(jù)，從孢子化卵囊的形態(tài)、大小以及形狀指數(shù)等方面進(jìn)行判斷，結(jié)果與孫清平等2007年對揚州地區(qū)某規(guī)?；u場的調(diào)查結(jié)果基本一致[2]。這2次調(diào)查的對象均以肉雞為主，飼養(yǎng)周期短，這可能是調(diào)查所獲種類少的原因之一。另外，本次關(guān)于雞球蟲種類的調(diào)查方法，采用的是傳統(tǒng)而且常用的方法，是根據(jù)卵囊的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行種類鑒定，該方法雖然簡便，但是部分球蟲的卵囊形態(tài)特征差異不太明顯，往往容易混淆，所得的結(jié)果也不十分可靠，特別是部分形態(tài)結(jié)構(gòu)難以區(qū)分的種類往往容易混淆。為此，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了不少探索和研究，形成了如腸道內(nèi)生發(fā)育階段和病變觀察、同工酶技術(shù)、多重PCR技術(shù)等多種鑒定方法，在條件允許的情況下，在開展球蟲種類調(diào)查時應(yīng)該2種以上方法相結(jié)合，這樣結(jié)果才更可靠[1-2]。

（2）關(guān)于不同地區(qū)雞球蟲種類和分布，國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了大量調(diào)查，大量研究報道表明，許多因素如地區(qū)地理因素、日齡、品種、飼養(yǎng)方式等均會影響球蟲的種類分布及優(yōu)勢蟲株的組成。余明（1997）等[3]通過卵囊雞體內(nèi)增殖對四川遂寧某種雞場的種雞球蟲感染情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲和堆形艾美耳球蟲等4種球蟲感染。金玉亮（1998）等[4]對哈爾濱地區(qū)的6個肉雞和種雞場球蟲感染狀況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)主要有3種球蟲，即柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和和緩艾美耳球蟲存在，其中柔嫩艾美耳球蟲的感染強度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于另外2種，是該地區(qū)的主要致病種。楊發(fā)龍（2001）等[5]對成都地區(qū)5個郊縣或郊區(qū)的9個雞場的57只雞進(jìn)行了雞球蟲種類的初步調(diào)查，發(fā)現(xiàn)成都地區(qū)雞球蟲種類有世界公認(rèn)的7個種中的6個種，即柔嫩、毒害、和緩、早熟、巨型及布氏艾美氏球蟲，其中以柔嫩、早熟及和緩艾美爾球蟲占優(yōu)勢，其中柔嫩艾美爾球蟲危害最大，被應(yīng)視為防治重點。杜愛芳（2002）等[6]對杭州地區(qū)的杭州市區(qū)、桐廬及建德等地的大型雞場及個體養(yǎng)雞場球蟲感染情況進(jìn)行了調(diào)查，通過對球蟲卵囊的分離、培養(yǎng)，孢子生殖階段蟲體的形態(tài)觀察，卵囊、孢子囊大小及卵囊孢子化時間的測定，初步將卵囊分為A型、B型、C型3種類型，并通過分別用這3種卵囊接種雛雞純繁后，收集的卵囊人工感染15日齡的小雞，觀察并記錄接種后的發(fā)病時間，癥狀及病理變化等，鑒定球蟲種類主要存在3個種，分別是柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲，而且籠養(yǎng)雞的球蟲感染種類和強度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于地面平養(yǎng)和網(wǎng)上平養(yǎng)。陶建平（2003）等[7]對送檢揚州大學(xué)動物醫(yī)院50只雞的球蟲感染情況調(diào)查顯示，15日齡以內(nèi)雞的球蟲感染率為20%，15～50日齡雞為96.5%，50日齡以上雞為100%，總感染率為90%。共檢出7種球蟲，即柔嫩艾美耳76%、堆型艾美耳56%、巨型艾美耳22%、早熟艾美耳16%、和緩艾美耳10%、毒害艾美耳4%和布氏艾美耳2%。柔嫩和堆型為優(yōu)勢種。球蟲多為混合感染的占71.1%，2種球蟲混合感染最多占44.4%。陳麗鳳（2003）等[8]對秦皇島地區(qū)10個養(yǎng)雞場雞球蟲種類的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)6種球蟲，分別是哈氏艾美耳球蟲（34%）、柔嫩艾美耳球蟲（26%）、早熟艾美耳球蟲（12%）、和緩艾美耳球蟲（12%）、堆形艾美耳球蟲（11%）和毒害艾美耳球蟲（5%）。宋建強（2003）等[9]從武漢郊區(qū)多個雞場采回糞便，對艾維茵肉雞進(jìn)行感染，通過卵囊的實驗室鑒定和雞的病理剖檢，初步鑒定出武漢地區(qū)雞球蟲有柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、堆形艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲等6種，主要致病蟲株為柔嫩艾美耳球蟲和堆形艾美耳球蟲，與陳麗鳳不同的是未發(fā)現(xiàn)可疑種哈氏艾美耳球蟲。李培英（2004）等[10]對合肥市79份雞的糞樣進(jìn)行了雞球蟲感染情況的檢查，經(jīng)鑒定所獲7種球蟲為毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、哈氏艾美耳球蟲和早熟艾美耳球蟲，球蟲感染率存在一定的地區(qū)性和日齡差異，與其他報道所不同的是該地區(qū)雞球蟲優(yōu)勢蟲種為毒害艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲。肖寒（2008）等[11]對安徽省5個縣（區(qū)）雞球蟲種類及感染情況進(jìn)行了調(diào)查，172份雞的新鮮糞樣，得出雞球蟲感染率為100%，共檢出7種球蟲，經(jīng)鑒定均隸屬于艾美耳屬，分別為毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、哈氏艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲。本次對海安縣某雞場的調(diào)查結(jié)果表明該雞場主要有柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲，其中柔嫩艾美耳球蟲是主要的優(yōu)勢種。以上報道表明，不同地區(qū)、不同日齡以及不同飼養(yǎng)方式等因素均會影響球蟲種類和感染強度，在制定具體的治措施時，要合理選擇和使用藥物，要在詳細(xì)調(diào)查和鑒定基礎(chǔ)上制定防治方案，最好能針對優(yōu)勢蟲株或混合蟲株開展抗藥性監(jiān)測，合理選擇藥物，提高藥物防治的效果，減少和延緩耐藥性的產(chǎn)生，以進(jìn)一步減少因球蟲導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。

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