雞和緩艾美耳球蟲早熟蟲株選育及其生物學(xué)特性研究

王 娟，劉永清，高永剛，梁 偉，閔長安，付改玲，張文葉，鄭潤寬

（1.內(nèi)蒙古神元生物工程股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

雞和緩艾美耳球蟲早熟蟲株選育及其生物學(xué)特性研究

王 娟1*，劉永清1*，高永剛1，梁 偉1，閔長安1，付改玲1，張文葉1，鄭潤寬2

（1.內(nèi)蒙古神元生物工程股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

按照J(rèn)effers1975年建立的艾美耳屬球蟲早熟蟲株選育方法，對雞和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）進(jìn)行了單卵囊分離、擴(kuò)增和早熟蟲株的選育。經(jīng)SPF雞15代傳代之后，分離株的潛隱期由96 h縮短至77 h，縮短了19 h。按索勛等1998年建立的方法對選育出的和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株（SY-mb77株）進(jìn)行10代非選擇性傳代，證明該早熟蟲株的潛隱期、卵囊產(chǎn)量、免疫原性和致病性均具備早熟蟲株特性，并能有效抵抗強(qiáng)毒蟲株的攻擊。

雞和緩艾美耳球蟲；早熟蟲株；選育；生物學(xué)特性

我國的雞艾美耳球蟲病十分普遍，其發(fā)病率50%～70%；死亡率20%～30%，嚴(yán)重時達(dá)80%［1］。在雞病中，雞球蟲病占16%～20%［2］。每年我國養(yǎng)雞量達(dá)30億～60億羽，按0.2～0.3元/只計算［3］，我國每年抗球蟲藥支出6億～18億元。時至今日該病的防治仍然嚴(yán)重依賴各種化學(xué)抗球蟲藥物。為了有效控制雞球蟲病發(fā)生、減少化學(xué)藥物的使用，應(yīng)大力提倡綠色無公害防治技術(shù)，積極開發(fā)、應(yīng)用雞球蟲疫苗。該研究目的在于選育雞球蟲早熟弱毒疫苗的抗原蟲株。

2003年筆者在內(nèi)蒙古巴彥淖爾市某雞場分離到1株和緩艾美耳球蟲，經(jīng)單卵囊分離擴(kuò)增和毒力測定后，確定為潛隱期96 h的強(qiáng)毒蟲株，排卵囊高峰在感染后第6天，該蟲株記為和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）。以下將對和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）進(jìn)行早熟選育，并對選育出的和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株 （SY-mb77株）的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼料 1～2周齡SPF雞飼養(yǎng)于專用隔離器內(nèi)。飼料無球蟲污染，無抗球蟲藥物添加。

1.2 試驗(yàn)蟲株 和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SYMB株）由內(nèi)蒙古神元生物工程股份有限公司分離、鑒定、保存。

1.3 早熟選育

1.3.1 蟲株復(fù)壯：取和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）孢子化卵囊保存液，在2 500 r/min下離心10 min，棄去保存液，加等量蒸餾水重懸。取10 μL重懸的卵囊液加蒸餾水稀釋成1 mL，再取10 μL滴在載玻片上進(jìn)行卵囊計數(shù)，重復(fù)2次，按平均數(shù)配制成每毫升含卵囊為2×103個的卵囊液。選7日齡SPF雞5只，每只經(jīng)口接種卵囊液1 mL，收集接種后4～7 d的糞便，分離卵囊并進(jìn)行孢子化后，加蒸餾水配成2×103個/mL的卵囊液，用于早熟蟲株的選育。

表1 和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株的選育

1.3.2 早熟蟲株的選育：按Jeffers創(chuàng)立的艾美耳球蟲早熟蟲株選育方法進(jìn)行［4］，7日齡SPF雞經(jīng)口接種上述孢子化卵囊1 mL。之后每日檢查糞便，在卵囊排出前每2 h檢查糞便，用飽和鹽水漂浮法檢查其中有無球蟲卵囊出現(xiàn)，將最早檢出卵囊的時間記為該次傳代的潛隱期，收集最初數(shù)小時排出的卵囊，重復(fù)以上傳代過程，直至潛隱期縮短到一定程度為止。該試驗(yàn)對和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SYMB株）進(jìn)行了15次傳代，標(biāo)記為P0、P1、P2、……P15（F0代），進(jìn)行15次傳代后所得到的和緩艾美耳球蟲記為和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株（SY-mb77株）。

1.4 早熟蟲株的生物學(xué)特性研究

1.4.1 早熟蟲株潛隱期測定：14日齡 SPF雞 10只，每只經(jīng)口接種和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株（SY-mb77株）孢子化卵囊2×103個，感染后每日收糞檢卵，按最早檢出卵囊時間確定潛隱期。連續(xù)感染10代次，檢測每次感染的潛隱期。

1.4.2 早熟蟲株的繁殖力測定：將80只14日齡SPF雞分成A、B、C、D、E、F、G、H共8組，每組10只。A、B組每只雞接種2×103個和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株（SY-mb77株）孢子化卵囊；C、D組每只雞接種 2×103個和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）孢子化卵囊；E、F組每只雞接種1×104個和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株 （SY-mb77株）孢子化卵囊；G、H組每只雞接種1×104個和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）孢子化卵囊。比較親本株與早熟株的產(chǎn)卵囊量，進(jìn)行繁殖力評估。

1.4.3 早熟蟲株的致病力測定：選取90只7日齡SPF雞分成3個組，每組30只雞，10只雞為一個試驗(yàn)小組，共設(shè)3個重復(fù)。第1組每只接種1×105個和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株 （SY-mb77株）孢子化卵囊，第2組每只雞接種1×105個和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）孢子化卵囊，第3組不感染為對照組。接種后計算1～10 d內(nèi)的平均增重量，以評價和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株（SY-mb77株）的致病性。

1.4.4 早熟蟲株的免疫原性測定：選取90只14日齡SPF雞分成3個組，每組30只雞，10只雞為一個試驗(yàn)小組，共設(shè)3個重復(fù)。第1組和第2組在10日齡分別用4.0×102個和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株（SY-mb77株）及和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）孢子化卵囊免疫，第3組不免疫為對照組；免疫后第14天時3個組均用5×104個和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）孢子化卵囊攻蟲，用各免疫組與對照組卵囊產(chǎn)量作為判斷免疫原性的指標(biāo)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 早熟蟲株選育結(jié)果 和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）在傳到13代時其潛隱期由96 h縮短為77 h，縮短了19 h，且后續(xù)傳代顯示穩(wěn)定（結(jié)果見表1）。

2.2 早熟蟲株的生物學(xué)特性研究結(jié)果

2.2.1 早熟蟲株潛隱期測定結(jié)果：通過10代非選擇性傳代，已選育的和緩艾美耳球蟲早熟株的潛隱期均為77 h，保持了良好的遺傳穩(wěn)定性（結(jié)果見表2）。

2.2.2 早熟蟲株繁殖力測定結(jié)果：表3為和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株（SY-mb77株）與和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）的卵囊產(chǎn)量，數(shù)據(jù)表明，與相同劑量的親本株相比，早熟株的卵囊產(chǎn)量顯著降低。

表2 和緩艾美耳球蟲早熟株潛隱期測定

表3 早熟蟲株與親本蟲株的繁殖力比較

2.2.3 早熟蟲株的致病力測定結(jié)果：和緩艾美耳球蟲早熟株致病力試驗(yàn)的結(jié)果見表4。與親本蟲株組相比，在相同的接種劑量下，早熟蟲株組的試驗(yàn)雞的體重增長明顯高于親本蟲株組（P<0.05），說明和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株（SY-mb77株）的致病性明顯降低。

表4 和緩艾美耳球蟲早熟株致病力試驗(yàn)結(jié)果

統(tǒng)計學(xué)分析表明，第1組與第3組無統(tǒng)計學(xué)差異；而接種親本株的第2組和接種早熟株的第1組、對照組相比較，均有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2.4 早熟蟲株的免疫原性測定結(jié)果：和緩艾美耳球蟲早熟株與親本株卵囊的免疫原性測定結(jié)果見表5。以4×102個孢子化卵囊為1個免疫劑量，分別接種試驗(yàn)雞后，第14天用5×104個親本株卵囊攻蟲，以第4天至第8天每雞的產(chǎn)卵囊量評價早熟蟲株、親本蟲株的免疫原性。結(jié)果表明：接種早熟株、親本株卵囊的試驗(yàn)雞的產(chǎn)卵量比對照組雞極顯著降低（P<0.01），分別降低20倍和300倍以上，有效地抵抗了強(qiáng)毒蟲株的攻擊，表明該2個蟲株均有良好的免疫原性。

表5 和緩艾美耳球蟲早熟株與親本株免疫原性測定

由于和緩艾美耳球蟲的致病力弱，攻蟲不出現(xiàn)試驗(yàn)雞死亡，故以卵囊產(chǎn)量評估其免疫原性為行業(yè)公知。

3 結(jié)論

該研究取得以下結(jié)論：以和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾株（SY-MB株）為親本蟲株，經(jīng)15代早熟選育，獲得了潛隱期為77 h的早熟蟲株——和緩艾美耳球蟲巴彥淖爾早熟株（SY-mb77株）。對該早熟蟲株的進(jìn)一步研究證明，早熟蟲株具有良好的遺傳穩(wěn)定性和免疫原性，并且致病性和產(chǎn)卵量降低，可作為雞球蟲病活疫苗的抗原蟲株。

4 討論

公認(rèn)的7種有致病力的雞艾美耳球蟲中［5-6］，和緩艾美耳球蟲是致病性較低的一種。筆者在巴彥淖爾市某雞場分離到1株和緩艾美耳球蟲，經(jīng)單卵囊分離擴(kuò)增后，測得其潛隱期為96 h，排卵囊高峰在感染后第6天；用1×105個孢子化卵囊經(jīng)口接種試驗(yàn)雞發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)雞接種后2周內(nèi)的增重較對照組低10%以上，說明該株和緩艾美耳球蟲有一定的致病性。

自Jeffers1975年首次報道雞柔嫩艾美耳球蟲早熟株選育以來［7］，世界各國相繼報道了毒害艾美耳球蟲［7］、巨型艾美耳球蟲［8］和堆型艾美耳球蟲［9］的早熟選育。該試驗(yàn)針對和緩艾美耳球蟲的早熟選育同樣采用了Jeffers的方法，選育后的早熟蟲株的潛隱期縮短、排卵囊高峰提前、卵囊產(chǎn)量（繁殖力）下降、致病性降低，但保持了免疫原性，符合早熟蟲株的標(biāo)準(zhǔn)。

［1］孔繁瑤.家畜寄生蟲學(xué)［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1981.

［2］左仰賢.球蟲學(xué)——畜禽和人體的球蟲與球蟲病［M］.天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1991.

［3］郁明發(fā).雞球蟲病［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，1989（1）：36-37.

［4］JEFFERS T K.Attenuation of Eimeria tenella through selection for precociousness［J］.J Parasitol，1975，61（6）：1083-1090.

［5］索勛，李國清.雞球蟲病學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998.

［6］WILLIAMS R B，BUSHELL A C，REPERANT J M，et al.A survey ofEimeria speciesin commercially-reared chickens in France during 1994 ［J］.Avian Pathol，1996，25（1）：113-130.

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［8］SHIRLEY M W，BELLATTIM A.Live attenuated coccidiosis vaccine：selection of a second precocious line of Eimeria maxima［J］.Res Vet Sci，1988，44（1）：25-28.

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Selection and Biological Characteristic of Precocious Strain of Chicken Eimeria mitis

WANG Juan1*，LIU Yong-qing1*，GAO Yong-gang1，LIANG Wei1，MIN Chang-an1，F(xiàn)U Gai-ling1，ZHANG Wen-ye1，ZHENG Run-kuan2
（1.Inner Mongolia Shenyuan Bioengineering Co.，Ltd.，Hohhot 010010，China；2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Hohhot010031，China）

The single oocyst separation,propagation and precocious strain selection were conducted in a strain of chicken Eimeria mitis designated as SY-MB which was isolated from Bayannur region of Inner Monlolia according to the methods established by Jeffers in 1975.After 15 successive generations inoculation,the latent period of the isolated strain was 19 hours shorted （from 96 hours to 77 hours）.The selected precocious strain designated as SY-mb77 was unselectively sub-cultured for 10 generations by the methods reported by Sunxun and others in 1998.The latent period,oocyst production,immunogenicity and pathogenicity of the selected strain possessed the characteristic of a typical precocious strain.The precocious strain can effectively protect the inoculated chickens from invasion of high virulent strain.

chicken Eimeria mitis；precocious strain；selection；biological characteristic

S852.72；S852.43

A文章順序編號：1672-5190（2016）09-0015-04

2016-08-24

項(xiàng)目來源：呼和浩特市重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目（2011-合-4）。

王娟（1986—），女，主要從事雞球蟲早熟弱毒疫苗的研究工作。劉永清（1983—），男，主要從事雞球蟲早熟弱毒疫苗的研究工作。

*王娟、劉永清為并列第一作者。

鄭潤寬（1957—），男，研究員，碩士，主要研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。

（責(zé)任編輯：錢英紅）