血清DLL1的檢測(cè)在結(jié)核性腦膜炎診斷中的價(jià)值

沈萍 魯晶晶 李盡義 彭濤 賈延劼

結(jié)核病是當(dāng)今世界上引起死亡人數(shù)最多的傳染病之一。在我國(guó)近幾年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，結(jié)核性腦膜炎也隨之多見，但目前尚無(wú)特異敏感的診斷方法，誤診率較高。致病結(jié)核桿菌在宿主體內(nèi)的生存能力與其氧化脂肪酸的能力有關(guān)。Delta-Like-1(DLL1)屬于Notch配體，而 Notch1信號(hào)在脂肪代謝中起到重要作用［1］。本研究通過對(duì)結(jié)核性腦膜炎，病毒性腦膜炎，顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤及健康對(duì)照組患者血清的DLL-1水平進(jìn)行檢測(cè)，探討其臨床診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年5月至2010年11月入住新鄭市人民醫(yī)院和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及兒科的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的患者45例，均嚴(yán)格按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)確定診斷。分為結(jié)核性腦膜炎患者26例，作為結(jié)腦組，男10例，女16例;年齡6～51歲，平均(21.2±14.5)歲;病毒性腦膜炎患者19例，作為病腦組，男12例，女7例，年齡5～50歲，平均(15.9±14.0)歲;正常對(duì)照組選擇無(wú)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、腫瘤、免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病而需要鑒別診斷的周圍神經(jīng)病變或頭痛等患者，共25例，男15例，女10例;年齡8～50歲，平均(17.5±18.3)歲。同時(shí)選擇顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤7例，作為腫瘤組，男4例，女3例，年齡42～70歲;平均(54.9±7.8)歲。

1.2 結(jié)腦的診斷標(biāo)準(zhǔn) ①年齡＞12周歲的24例患者按照Ahuja等［2］的TMB診斷標(biāo)準(zhǔn)(Ahuja標(biāo)準(zhǔn));②年齡≤12周歲的6例患者參照有Seth和Sharma［3］的標(biāo)準(zhǔn)(Seth標(biāo)準(zhǔn))。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 在獲得患者或其家屬知情同意的情況下，抽取外周靜脈血2 m1，采用不加抗凝劑的真空采血管收集，室溫30 min后，2000 r離心血清10 min，分離血清。所有標(biāo)本登記后，均放入-20℃冰箱保存。

1.3.2 DLL1的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)，試劑盒由韓國(guó)AdipoGen公司提供，按照說(shuō)明書操作。構(gòu)建一個(gè)通過繪制已知濃度(濃度)(Y)與吸光度(吸光率)(X)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。顯示一個(gè)可衡量的范圍通常顯示在(標(biāo)準(zhǔn)曲線)0.125ng/ml和8ng/ml之間。線性回歸成功，兩者相關(guān)系數(shù)為0.9996。通過回歸曲線插值公式，計(jì)算樣品的可溶性DLL1濃度，如下所示的一個(gè)二次方程公式:Y=-0.1045X2+7.514X-0.2449;r2=0.9984;DLL1濃度計(jì)算乘以稀釋倍數(shù)，以獲得該樣品稀釋前的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)以(±s)表示。多組間比較用方差分析(F檢驗(yàn))或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)或Bonferroni法。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

血清中DLL1的含量測(cè)定結(jié)果 表1提示，結(jié)腦組、病腦組、對(duì)照組分別為［(17.25±6.91)，(1.32±3.57)，(0.99±1.84)ng/ml］，結(jié)腦組與病腦組、對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.31，P＜0.01)，病腦組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.114，＞0.05)。

表1 各組血清中DLL1的含量的比較(x ± s，ng/ml)

3 討論

結(jié)核性腦膜炎的早期診斷、及時(shí)治療，直接關(guān)系到患者的預(yù)后，是降低病死率和并發(fā)癥的關(guān)鍵［2］。但是臨床上結(jié)核性腦膜炎腦脊液常呈不典型改變，易被誤診。本研究即為了尋找診斷結(jié)核性腦膜炎更有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

結(jié)核桿菌全基因組有4411529bp，包括4000余個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因，其中具有250多個(gè)編碼脂肪酸代謝的酶的基因，比大腸桿菌相關(guān)酶類多了4倍以上。結(jié)核桿菌細(xì)胞壁所含的脂類約占細(xì)胞壁干重的60%［4］，其含量與細(xì)菌毒力密切相關(guān)，含量越高毒力愈強(qiáng)。這些證據(jù)均說(shuō)明了脂肪代謝對(duì)結(jié)核桿菌的重要性［5］。

DLL1是果蠅的Notch配體Delta人類同源體，是723個(gè)氨基酸組成的L型跨膜蛋白，與小鼠DLL1蛋白質(zhì)相比有88%是相同的，有一個(gè)DSL區(qū)域跟隨8個(gè)串聯(lián)的EGF(表皮生長(zhǎng)因子)樣重復(fù)序列和1個(gè)簡(jiǎn)短的細(xì)胞質(zhì)的C-端區(qū)域［6］。DLL1與Notch結(jié)合，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化進(jìn)程［7］。Notch是一組跨膜受體，在多種器官及細(xì)胞的發(fā)育中起作用，主要決定細(xì)胞的分化方向。近年研究表明，Notch信號(hào)通路的抑制、基因突變或異常激活可能與許多疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、腦卒中、腫瘤、腦再灌注損傷等尤其是腦腫瘤的發(fā)生有關(guān)［8］。Notch1及其配體DLL1在顱內(nèi)感染性疾病中的報(bào)道很少。

結(jié)果表明，結(jié)核性腦膜炎組中血清DLL1含量也明顯高于其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染組別，26例結(jié)腦患者行DLL1測(cè)定，測(cè)定值中有22例(84%)＞6.0 ng/ml，而病腦及對(duì)照組各有1、0例＞6.0 ng/m，以大于該值為判斷值，也能與病腦及正常對(duì)照相鑒別。

結(jié)腦患者的血清DLL1含量升高的機(jī)制尚不完全清楚，可能如下:(1)結(jié)核病是一種慢性消耗性病變，引起脂肪等代謝紊亂;DLL1可能也參與了脂肪細(xì)胞的分化和自我更新;結(jié)腦患者代謝紊亂增強(qiáng)，DLL1脫落有助于Notch信號(hào)在鄰近細(xì)胞的下調(diào)并促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化進(jìn)程［7］。(2)當(dāng)結(jié)核菌侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后引起結(jié)核性腦膜炎時(shí)，因局部的免疫反應(yīng)，使T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多、增殖、分化;T淋巴細(xì)胞增多需要Notch信號(hào)途徑的激活。Kapoor等發(fā)現(xiàn)在結(jié)核性腦膜炎患者腦內(nèi)結(jié)核性肉芽腫中Notch信號(hào)途徑的激活［9］。(3)DLL1通過支架蛋白MAGI1，位于神經(jīng)細(xì)胞突起的粘附連接里，當(dāng)結(jié)核性腦膜炎導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞粘附連接損傷后，DLL1可能釋放出來(lái)，從而使得DLL1的含量增高［10］。

綜上所述，結(jié)核性腦膜炎患者的血清中DLL1的含量均有明顯增高，對(duì)血清中DLL1的含量進(jìn)行檢測(cè)，不僅方法簡(jiǎn)單，而且為結(jié)核性腦膜炎的診斷提供了新的思路。

［1］Liu RZ，Eu M.Fatty acid binding proteins in brain development and disease.Int J Dev Biol，2010，54:1229-1239.

［2］Ahuja GK，Mohan KK，Prasad K，et al.Diagnostic criteria for tuberculous meningitis and their validation.Tuber Lung Dis，1994，75:149-152.

［3］Seth R，Sharma U.Diagnostic criteria for tuberculous meningitis.Indian J Pediatr，2002，69:299-303.

［4］Cole ST，Brosch R，Parkhill J，et al.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence.Nature，1998，393:537-544.

［5］Purohit HJ，Cheema S，Lal S，et al.In search of drug targets for mycobacterium tuberculosis.Infect Disord Drug Targets，2007，7:245-250.

［6］Murata A，Okuyama K，Sakano S，et al.A notch ligand，deltalike functions as an adhesion molecule for mast cells.J Immunol，2010，185:3905-3912.

［7］Garcés C，Ruiz-Hidalgo MJ，F(xiàn)ont de Mora J，et al.Notch-1 controls the expression of fatty acid-activated transcription factors and isrequired foradipogenesis. J BiolChem， 1997， 272:29729-29734.

［8］Nickoloff BJ，Osborne BA，Miele L.Notch signaling as a therapeutic target in cancer:a new approach to the development of cell fate modifying agents.Oncogene，2003，22:6598-6608.

［9］Kapoor N，Narayana Y，Patil SA，et al.Nitric oxide is involved in Mycobacterium bovis bacillus calmette-guérin-activated jagged and notch signaling.J Immunol，2010，184:3117-3126.

［10］Mizuhara E，Nakatani T，Minaki Y，et al.MAGI1 recruits Dll1 to cadherin-based adherens junctions and stabilizes it on the cell surface.J Biol Chem，2005，280:26499-26507.