劉穎 陳鎮(zhèn) 葛朝亮 夏泉 許杜娟

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230022)

在前期研究[1]中，我們成功地建立了淺Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的燙傷小鼠模型，觀察了燒傷膏對創(chuàng)面皮膚愈合時間與愈合率和皮膚組織形態(tài)的修復(fù)情況，結(jié)果證明燙傷小鼠經(jīng)燒傷膏治療15 d后能明顯縮短皮膚創(chuàng)面愈合的時間，提高愈合率，并能顯著改善創(chuàng)面皮膚病理形態(tài)的恢復(fù)。但燙傷皮膚組織細(xì)胞有無自由基爆發(fā)？細(xì)胞中DNA有無損傷？燒傷膏修復(fù)燙傷皮膚組織細(xì)胞的作用機(jī)制是什么？本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測燙傷小鼠組織中的超氧自由基濃度和相關(guān)抗氧化酶活性和DNA慧星拖尾長度等實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，揭示燒傷膏治療燙傷皮膚的部分作用機(jī)制。

1 材枓與方法

1.1 藥品與試劑

燒傷膏由我科制劑研究室制備，批號20101124；超氧化物歧化酶（SOD），超氧陰離子（·O2－）、羥自由基（·OH）及過氧化氫（H2O2）測定試劑盒等均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；四乙氧基丙烷（TEP)，瑞士Fluka產(chǎn)品；正常熔點(diǎn)瓊脂糖（NMPA）和低熔點(diǎn)瓊脂糖（LMPA），均為Pharmacia公司產(chǎn)品，溴化乙錠，AMRESCO公司產(chǎn)品，十二烷基肌氨酸鈉，二甲基亞砜，三羥甲基氨基甲烷，Triton-100，均為Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑均為市售國產(chǎn)分析純。

1.2 動物

昆明種健康小鼠，雌雄各半，體重18～ 22 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號為皖醫(yī)動準(zhǔn)字01號。

1.3 儀器

HH-W600數(shù)顯恒溫水浴箱（金壇市精達(dá)儀器制造廠）；HG-101-5電熱鼓風(fēng)干燥箱（南京實(shí)驗(yàn)儀器廠）；DYCP-38BA電泳槽和DYY-11B三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠）；TDL-16C高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BX41熒光顯微鏡和顯微鏡成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）；721分光光度計(jì)（上海第三儀器廠）。

1.4 小鼠皮膚燙傷模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組

按我們建立的燙傷小鼠模型方法[1]，取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只。即①正常對照組，②燙傷模型組，③、④、⑤為燒傷膏高、中、低劑量組。①組和②組小鼠每日均于背部脫毛區(qū)涂抹燒傷膏基質(zhì)麻油1 g；③～⑤組小鼠每日均于背部脫毛區(qū)涂抹燒傷膏1 g，相應(yīng)的劑量分別為13.4、26.8及53.6 g/kg，早晚各1次，連續(xù)給藥15 d。

1.5 抗氧化酶活性和自由基濃度的測定[2]

于末次給藥后2 h，拉頸處死小鼠，小心取下創(chuàng)面皮膚（盡量剝盡皮下脂肪），精密稱取2 g左右，在冰浴中加入預(yù)冷的生理鹽水制成10%的細(xì)胞懸液，4 000 r/min離心5～10 min，取上清，用于測定各項(xiàng)指標(biāo)。檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行：SOD采用黃嘌呤氧化酶法，LPO采用硫代巴比妥酸（TBA）比色分析法，以代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）為計(jì)量單位，H2O2采用化學(xué)比色法，·OH采用發(fā)光比色的方法測定含量?！2－自由基采用模擬黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生·O2－，用化學(xué)比色法測定含量。皮膚細(xì)胞中蛋白用Lorry法測定。單位以每mg中的摩爾濃度或國際單位表示。

1.6 DNA慧星實(shí)驗(yàn)

于末次給藥后2 h，拉頸處死小鼠，細(xì)心取下創(chuàng)面皮膚（盡量剝盡皮下脂肪），精密稱取2 g左右，在冰浴中加入4℃預(yù)冷的適量無Ca2+、Mg2+的PBS，用手術(shù)剪反復(fù)剪成1～3 mm3米粒狀，然后加入0.3%膠原酶（pH 6.5)。置36.5℃水浴中消化2 h，其間不斷振搖，用200 μm銅網(wǎng)篩過濾，然后1 000 r/min離心5 min，取細(xì)胞沉淀物用PBS制成細(xì)胞懸浮液，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。用臺盼藍(lán)染色法測定細(xì)胞存活率并調(diào)整細(xì)胞濃度為103～105/mL置于冰浴中備用。按文獻(xiàn)方法[3]進(jìn)行電泳，結(jié)果在熒光顯微鏡（610 nm激發(fā)波長)下觀察。每個劑量組拍攝100個細(xì)胞，計(jì)數(shù)其中的拖尾細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡慧星拖尾百分率。采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量慧星頭長和全長，由此計(jì)算慧星尾長。計(jì)算公式：慧星尾長（μm）=慧星全長－慧星頭長。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測所得數(shù)據(jù)均用±s表示，各組間用單因素方差分析比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義，以P＜0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 燒傷膏對燙傷小鼠皮膚組織中超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫生成的影響

由表1可以看出，燙傷模型組小鼠皮膚組織中的超氧·O2－、·OH以及氧自由基的代謝產(chǎn)物H2O2的含量都明顯高于正常組，差異十分顯著（P均＜0.01），表明皮膚組織燙傷后可以誘發(fā)皮膚細(xì)胞中自由基濃度異常升高。當(dāng)燙傷小鼠連續(xù)外涂燒傷膏15 d后，發(fā)現(xiàn)燒傷膏低、中、高劑量組均能明顯降低皮膚細(xì)胞中自由基的含量（P均＜0.01），揭示燒傷膏具有抑制或減少燙傷皮膚細(xì)胞中自由基生成的作用。

2.2 燒傷膏對燙傷小鼠皮膚組織中SOD活性和LPO濃度的影響

正常組皮膚細(xì)胞中SOD活性為（225.31±14.52）U/mg，模型組皮膚細(xì)胞中SOD活性為（32.54±5.48）U/mg，兩者差異有高度統(tǒng)計(jì)意義（P＜ 0.01）。正常組皮膚細(xì)胞中MDA濃度為（1.28± 0.47）nmol/L，遠(yuǎn)低于模型組皮膚細(xì)胞MDA（10.65± 2.35）nmol/L，表明皮膚在燙傷后細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA濃度大量升高（P＜0.01）。當(dāng)燙傷小鼠連續(xù)外涂燒傷膏15 d后，發(fā)現(xiàn)藥物組的低、中、高劑量組皮膚細(xì)胞中的SOD活性升高明顯，而MDA濃度則隨著劑量的加大而相應(yīng)降低，其中以高劑量組效果最佳（P均＜0.01）。提示燒傷膏有明顯地提高SOD活性和減少皮膚細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物生成的作用(見表2)。

表1 燒傷膏對燙傷小鼠皮膚組織細(xì)胞中自由基濃度的影響（±s,n=10）

表1 燒傷膏對燙傷小鼠皮膚組織細(xì)胞中自由基濃度的影響（±s,n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，下同

組別 劑量（g/kg）·O2－(U/g prot)·OH(U/mg prot)H2O2(mmol/L)正常組 - 125.01±6.58** 19.25±1.38** 25.52±3.54**模型組 - 279.35±13.44 85.04±5.36 120.57±8.65燒傷膏組 13.4 247.06±9.17* 50.27±2.71** 76.14±4.21**26.8 206.47±8.34** 44.14±2.57** 50.49±3.75**53.6 186.45±7.52** 36.88±1.68** 40.05±2.25**

表2 燒傷膏對燙傷小鼠皮膚組織細(xì)胞中SOD和LPO的影響（±s,n=10）

表2 燒傷膏對燙傷小鼠皮膚組織細(xì)胞中SOD和LPO的影響（±s,n=10）

組別 劑量（g/kg）SOD(U/mg prot)MDA(nmol/L)正常組 - 225.31±14.52** 1.28±0.47**模型組 - 32.54±5.48 10.65±2.35燒傷膏組 13.4 45.47±6.84* 5.34±0.50**26.8 142.08±10.52** 3.45±0.81**53.6 174.66±12.75** 2.57±0.72**

2.3 燒傷膏對燙傷小鼠皮膚細(xì)胞慧星細(xì)胞百分率和慧星尾長的影響

從表3可看出，燙傷模型組小鼠皮膚組織細(xì)胞中慧星拖尾細(xì)胞百分率高達(dá)97%，大大超過正常組，同時慧星細(xì)胞尾長也顯著增加，與正常對照組對比，差異有高度統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.01)，說明絲裂霉素（MMC）能造成小鼠骨髓淋巴細(xì)胞DNA損傷。而預(yù)先外涂燒傷膏15 d后，與模型組小鼠比較，可發(fā)現(xiàn)燒傷膏三個劑量組小鼠骨髓淋巴細(xì)胞中含有DNA慧星細(xì)胞數(shù)量和拖尾長度均顯著減少 (P均＜0.01)，且呈明顯的量效關(guān)系，提示燒傷膏對MMC誘發(fā)的小鼠骨髓細(xì)胞DNA損傷具有明顯的拮抗作用 (見表3及圖 1)。

表3 燒傷膏對燙傷小鼠皮膚細(xì)胞慧星細(xì)胞百分率和慧星尾長的影響（±s，n=10）

表3 燒傷膏對燙傷小鼠皮膚細(xì)胞慧星細(xì)胞百分率和慧星尾長的影響（±s，n=10）

組別 劑量（g/kg）觀察細(xì)胞數(shù) 拖尾細(xì)胞 尾長(μm)數(shù)量正常組 - 100 3 3.0 16.12±2.45**模型組 - 100 97 97.0 165.14±7.06 13.4 100 75 75.0 106.27±5.41**26.8 100 61 61.0 58.01±3.45**53.6 100 42 42.0 35.44±3.22**百分率（%）燒傷膏組

圖1 燙傷小鼠皮膚細(xì)胞DNA慧星電泳及燒傷膏的治療作用

3 討論

自由基學(xué)說是由美國科學(xué)家Harman在1955年首次提出的，他認(rèn)為在機(jī)體有氧代謝中會產(chǎn)生少量的·O2－，·OH和H2O2等自由基，在正常生理情況下，它們很快被體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)（如SOD、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX））或外源性抗氧化劑（如維生素 E和維生素C等）迅速清除，通常不會對機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生毒害。但在各種致病因素如感染、發(fā)熱、應(yīng)激、環(huán)境毒物接觸、輻射、污染等存在的情況下，能夠造成體內(nèi)抗氧化酶活性顯著下降，而大量自由基的生成無法得到及時清除，后者就會迅速攻擊細(xì)胞膜，并引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，造成細(xì)胞膜這一生物屏障破壞而影響細(xì)胞新陳代謝，有害的自由基進(jìn)而破壞胞內(nèi)生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類等，使DNA鏈斷裂、蛋白質(zhì)交聯(lián)變性、糖鏈斷裂、酶失活和信號通路障礙，最終誘發(fā)細(xì)胞死亡，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生腫瘤、衰老和發(fā)生各種疾病[2,4]。我們認(rèn)為，當(dāng)皮膚受到燒傷燙傷后，首先立即引起細(xì)胞生物結(jié)構(gòu)破壞或變性，繼而細(xì)胞內(nèi)在熱刺激下皮膚表皮和真皮細(xì)胞中產(chǎn)生大量的氧自由基，而抗氧化酶系統(tǒng)由于自身功能受損而無法清除過度激增的自由基，因而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，降解細(xì)胞內(nèi)生物大分子，同時引起細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎癥因子，血管通透性增大，局部組織水腫，形成繼發(fā)性感染，因此抗菌消炎為首選[5-9]。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與正常對照組比較，燙傷小鼠皮膚細(xì)胞中SOD活性顯著下降，而膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA和·O2－、·OH、H2O2等自由基的濃度卻相應(yīng)地異常升高，使DNA多聚核苷酸鏈與堿基對發(fā)生斷裂，因而DNA慧星拖尾長度顯著加長，提示皮膚燙傷后，皮膚正常屏障遭到破壞，會誘發(fā)自由基代謝紊亂、抗氧化能力下降以及DNA出現(xiàn)斷裂。當(dāng)連續(xù)給燙傷小鼠外涂燒傷膏15天后，發(fā)現(xiàn)燒傷膏可以增強(qiáng)燙傷小鼠皮膚細(xì)胞中的SOD活力，使·O2－、·OH、H2O2等自由基生成顯著減少，可以使細(xì)胞中的DNA免受自由基的攻擊，由此可見，燒傷膏治療皮膚燙傷的良好療效可能與提高機(jī)體抗氧化能力、清除自由基及保護(hù)DNA的作用機(jī)制有關(guān)。

[1]劉穎，陳鎮(zhèn)，夏泉，等.燒傷膏對燙傷小鼠創(chuàng)面病理修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中醫(yī)急癥雜志，2011，22(5)：757-759.

[2]陳勤.抗衰老研究實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1996：434-490.

[3]陳逸青，劉從云，陳學(xué)全，等.淫羊藿總黃酮對絲裂霉素致小鼠骨髓細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用[J].毒理學(xué)雜志，2010，24(3)：222-224.

[4]李勇，孔令青，高洪玉，等.自由基與疾病研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(4)：85-88.

[5]Shupp JW，Nasabzadeh TJ，Rosenthal DS，et al.A review of the local pathophysiologic bases of burn wound progression[J].J Burn Care Res，2010，31(6)：849-873.

[6]Parihar A，Parihar MS，Milner S，et al.Oxidative stress and anti-oxidative mobilization in burn injury[J].Burns，2008，34(1)：6-17.

[7]Singh V，Devgan L，Bhat S，et al.The pathogenesis of burn wound conversion[J].Ann Plast Surg，2007，59(1)：109-115.

[8]Evers LH，Bhavsar D，Mail?nder P.The biology of burn injury[J].Exp Dermatol，2010，19(9)：777-783.

[9]Dai T，Huang YY，Sharma SK，et al.Topical antimicrobials for burn wound infections[J].Recent Pat Antiinfect Drug Discov，2010，5(2)：124-151.