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      高甘油三酯血清對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用

      2011-09-03 08:45:08居峰吳劍吳文宏周曉霞
      中國合理用藥探索 2011年12期
      關(guān)鍵詞:培養(yǎng)液內(nèi)皮內(nèi)皮細(xì)胞

      居峰 吳劍吳文宏周曉霞

      (1江蘇省靖江市人民醫(yī)院,江蘇 靖江 214500;2揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225001)

      近年來,心腦血管疾病己成為當(dāng)今世界上威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一,其中動脈粥樣硬化(arteriosclerosis,AS)的發(fā)病率和死亡率位居前列。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙不僅是AS的一個始動環(huán)節(jié),還是導(dǎo)致其不斷進(jìn)展的重要因素。因此,改善和恢復(fù)血管內(nèi)皮功能已經(jīng)成為AS防治的重要目標(biāo)之一。

      在眾多導(dǎo)致AS的危險因素中,高甘油三酯血癥(HTG)與AS的關(guān)系則一直頗有爭議。近年來,國內(nèi)外一些新的流行病學(xué)研究資料及病理學(xué)研究表明,HTG是AS發(fā)生的獨(dú)立危險因素并在AS斑塊中發(fā)現(xiàn)有富含甘油三酯脂蛋白的類似物存在[1]。然而,在細(xì)胞水平上,高甘油三酯血清(High triglyceride blood serum,HTGBS)是否可直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷的相關(guān)研究報道甚少,故本研究采用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human vascular endothelial cell,HUVEC),觀察單純HTGBS對血管內(nèi)皮細(xì)胞活力、通透性、氧化及抗氧化能力和分泌功能等方面的影響。

      近年來,血紅素氧化酶-1/一氧化碳(hemeoxygenase-1,HO-1/CO)系統(tǒng)在心血管疾病中的作用受到了廣泛的關(guān)注。HO-1與其作用產(chǎn)物CO、鐵、膽綠素、膽紅素涉及許多生理和病理過程。本文將在細(xì)胞水平上初步觀察HTG所致HUVEC氧化損傷對HO-1/CO系統(tǒng)的影響,進(jìn)一步探討HTGBS致AS的機(jī)制。

      1 實(shí)驗(yàn)材料

      HUVEC細(xì)胞株由南京醫(yī)科大學(xué)提供;DMEM購自Gibco公司;新生牛血清購自杭州四季青公司;MTT購自Sigma公司;超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;HO-1(M-19)購自Santa Cruz公司。

      2 實(shí)驗(yàn)方法

      2.1 HTGBS的收集與處理

      從醫(yī)院收集人的正常血清及HTGBS,分別置于56℃水浴30 min滅活處理,并用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌。血清中的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及血糖(GLU)指標(biāo)均由醫(yī)院檢驗(yàn)科全自動生化分析儀檢測。

      2.2 HUVEC的傳代培養(yǎng)

      將HUVEC細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置37℃、5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長至近匯合狀態(tài)、鋪滿瓶壁80%以上時,進(jìn)行傳代。

      2.3 MTT法檢測HTGBS對HUVEC活力的影響

      2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

      ①陰性對照組:5%人正常血清;

      ②梯度濃度的HTGBS組:分別含HTGBS 1%、2%、3%、4%、5%(血清終濃度為5%,不足5%的部分用人正常血清補(bǔ)充);

      ③空白對照組:5%人正常血清(不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基)。

      2.3.2 操作步驟 細(xì)胞以5×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板,用含5%人正常血清的DMEM培養(yǎng)24 h后,換無血清DMEM(每組6孔)繼續(xù)培養(yǎng)。靜止培養(yǎng)24 h后按分組加入含不同濃度血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24~48 h;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每孔加入 MTT溶液(5 g/L)20 μL,37℃繼續(xù)孵育 4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加150 μL DMSO,振蕩均勻后于酶標(biāo)儀490 nm波長測吸光度(absorbance,A)值。

      2.4 細(xì)胞中LDH活性、MDA含量和SOD活性的測定

      分組同上,按說明書采用化學(xué)比色法測定細(xì)胞中LDH活性;硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)法測定MDA含量;黃嘌呤氧化酶法檢測細(xì)胞內(nèi)SOD活性。

      2.5 細(xì)胞中NO含量、總一氧化氮合酶(TNOS)和誘導(dǎo)型NOS(iNOS)活性的測定

      分組同上,用硝酸還原法測定細(xì)胞血管內(nèi)NO含量;用化學(xué)比色法測定內(nèi)皮細(xì)胞中TNOS和iNOS活性。

      2.6 ELISA測定碳氧血紅蛋白(Carboxyhemoglobin,COHb)的含量

      溶液中的CO很容易與血紅蛋白結(jié)合生成 COHb,通過測定培養(yǎng)基中COHb含量可以間接反映CO的生成,COHb測定參照Morita等[2]方法:消化單層培養(yǎng)細(xì)胞,以5×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中,用含5%人正常血清的DMEM培養(yǎng)24 h后,換無血清DMEM靜止培養(yǎng)24 h,實(shí)驗(yàn)分組同上(每組6孔),加入血清后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 h每孔加入牛血紅蛋白50 μmol/L,選擇570 nm波長,在酶標(biāo)儀上測定各孔培養(yǎng)上清液的A值。

      2.7 Western Blot檢測蛋白表達(dá)

      細(xì)胞以5×104/mL密度接種于50 mL培養(yǎng)瓶,用含5%人正常血清的DMEM培養(yǎng)24 h后,換無血清DMEM靜止培養(yǎng)24 h,實(shí)驗(yàn)分組同上,加入血清后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞收集在1.5 mL EP管,按說明書加入RIPA裂解液和PMSF,冰上裂解 30 min,4℃,12 000 rpm/min 離心 15 min,收集上清轉(zhuǎn)移到0.5 mL EP管,每組取100 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。PVDF膜濕轉(zhuǎn)(Bio-Rad),350 mA轉(zhuǎn)100 min,室溫封閉 1 h,一抗 4℃冰箱孵育過夜(1∶500),洗膜后二抗室溫孵育2 h(1∶500),洗膜后二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色。

      2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

      運(yùn)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理分析,計量資料以±s表示,兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗(yàn),多組間比較用方差分析。

      3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      3.1 人血清中 TC、TG、GLU的含量

      與正常血清相比,單純HTGBS中僅TG明顯升高(P<0.01),其余指標(biāo)屬于正常范圍,見表1。

      表1 混合血清中TC、TG、GLU的含量(±s)

      表1 混合血清中TC、TG、GLU的含量(±s)

      注:與正常血清組相比:*P<0.01

      分組(n=100)TC(mmol/L)TG(mmol/L)GLU(mmol/L)正常血清 4.51±0.03 1.25±0.02 5.2±0.13高甘油三酯血清 4.68±0.02 3.58±0.02* 5.0±0.10正常范圍 2.3~5.7 0.55~1.82 3.9~6.1

      3.2 相差顯微鏡下HUVEC形態(tài)

      正常血管內(nèi)皮細(xì)胞生長狀態(tài)良好,貼壁較牢,細(xì)胞間連接緊密;細(xì)胞呈多角形或短梭形,邊界清楚,大小均勻,呈單層鋪路石樣鑲嵌排列;胞核圓形或橢圓形,位于細(xì)胞中央,多核仁;胞漿豐富(圖1)。

      圖1 倒置相差顯微鏡下HUVEC形態(tài)(×100)

      3.3 MTT法檢測HTGBS對HUVEC活力的影響

      經(jīng)無血清抑制處理的HUVEC給予含5%正常血清(Control組)和含 1%、2%、3%、4%、5%HTGBS的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后490 nm處測得吸光度值,結(jié)果如圖2所示:1%,2%,3%的HTGBS可小幅度促進(jìn)HUVEC增殖,但4%、5%HTGBS明顯抑制HUVEC活力,與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)。由此確定HTGBS致HUVEC損傷的最佳實(shí)驗(yàn)濃度5%,最佳作用時間為24 h。

      圖2 不同濃度的HTGBS對HUVEC活力(MTT法測A值)的影響(±s,n=6)

      3.4 HTGBS對HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影響

      測定結(jié)果如表2所示:與正常對照組相比,HTGBS使得細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯升高(P<0.01);血管內(nèi)皮細(xì)胞中SOD活性降低,膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增加(P<0.01)。

      表2 HTGBS對HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影響(±s)

      表2 HTGBS對HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影響(±s)

      注:與Control組相比:*P<0.01

      分組(n=6)LDH(U/g prot)MDA(nmol/mg prot)SOD(U/mg prot)Control 0.128±0.014 0.261±0.033 20.083±1.909 HTGBS 0.277±0.030* 0.682±0.059* 15.959±2.084*

      3.5 HTGBS對HUVEC中NO含量、TNOS和iNOS活性的影響

      測定結(jié)果如表3所示:與正常對照組比較,HTGBS使HUVEC中NO含量、TNOS活性明顯降低(P<0.01);iNOS活性升高(P<0.01)。

      表3HTGBS對HUVEC中NO含量、TNOS和iNOS活性的影響(±s)

      注:與Control組相比:*P<0.01

      3.6 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)液中COHb含量的影響

      測定結(jié)果如表4,圖3所示:與正常對照組比較,HTGBS組HUVEC中HO-1蛋白表達(dá)代償性升高,細(xì)胞培養(yǎng)液中的COHb含量明顯增加(P<0.01)。

      表4 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)液中COHb 含量的影響(±s)

      表4 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)液中COHb 含量的影響(±s)

      注:與Control組相比:*P<0.01

      分組(n=6)HO-1蛋白表達(dá)(A值之比)COHb含量(A值)Control 0.640±0.042 0.136±0.016 HTGBS 0.828±0.063* 0.275±0.023*

      圖3 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達(dá)的影響(±s,n=6)

      4 討論

      AS已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,諸多因素參與其中,而內(nèi)皮細(xì)胞損傷作為始動環(huán)節(jié)之一已被公認(rèn)[3]。內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性是維持內(nèi)皮正常功能的前提,內(nèi)皮細(xì)胞損傷的原因較多,高脂血癥作為引發(fā)動脈粥樣硬化及心腦缺血性疾病的重要因素之一,主要在于其對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。高脂血癥可表現(xiàn)為高膽固醇血癥(HTC)、HTG或兩者兼有?,F(xiàn)有的文獻(xiàn)關(guān)于HTC與AS的關(guān)系研究比較透徹,而HTG與AS的關(guān)系則一直頗有爭議。我國膳食以高糖低脂為特點(diǎn),血脂紊亂以內(nèi)源性甘油三酯升高最為多見,因此研究HTG在AS發(fā)病中的作用機(jī)制及其防治具有特別的重要意義。鄭關(guān)毅等[4]的研究表明,單純性HTG患者和高血壓伴HTG的病人存在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)、抗氧化酶活性降低。目前已有實(shí)驗(yàn)研究[5]證實(shí),HTG患者及實(shí)驗(yàn)性HTG動物體內(nèi)均存有明顯的脂質(zhì)過氧化損傷,包括血漿脂質(zhì)過氧化物以及氧化修飾脂蛋白如氧化修飾低密度脂蛋白(LDL)、氧化修飾極低密度脂蛋白(VLDL)等含量增加。這些氧化修飾的脂蛋白均可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)AS的形成。

      MTT法是一種檢測細(xì)胞存活和生長增殖情況的方法,細(xì)胞活力(A值)能間接反映細(xì)胞的增殖和存活情況。LDH是糖酵解過程中一種重要的酶,廣泛存在于細(xì)胞漿中,當(dāng)細(xì)胞膜損傷、通透性增加時,胞漿中的LDH才大量釋放到細(xì)胞外,因此細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性的高低是反應(yīng)細(xì)胞受損傷程度的一個非常靈敏的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1%、2%、3%的HTGBS雖可小幅度促進(jìn)HUVEC增殖,但沒有統(tǒng)計學(xué)意義,但4%、5%HTGBS明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞活力,與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),因此以本實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),確定以含5%HTGBS為最佳實(shí)驗(yàn)濃度;HTGBS組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯高于正常對照組(P<0.01),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HTGBS可使血管內(nèi)皮細(xì)胞活力降低并致細(xì)胞損傷使其通透性增加。

      MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物,其含量的多少可反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD是機(jī)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分,主要清除O-2,抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。SOD活性的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合,對兩者結(jié)果分析具有一定生物學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,HTGBS組細(xì)胞中SOD活性明顯低于正常對照組(P<0.01),MDA含量明顯高于正常對照組(P<0.01),提示HTGBS可顯著增加脂質(zhì)過氧化物含量并降低細(xì)胞的抗氧化能力。

      正常生理情況下NO是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌的一種重要的信使分子和效應(yīng)分子,執(zhí)行重要的生物功能,包括擴(kuò)張血管、抗血小板聚集、抑制平滑肌細(xì)胞增殖等,其生物合成主要受NOS的調(diào)節(jié)。生物組織中已經(jīng)確定的NOS亞型有3種:神經(jīng)元型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)、iNOS,前兩者又合稱為結(jié)構(gòu)型 NOS(cNOS),三者總稱TNOS。

      在AS病變發(fā)展過程中,內(nèi)皮功能受損,內(nèi)皮源性cNOS表達(dá)或活性下降,內(nèi)皮源性NO產(chǎn)生減少,而iNOS活性增加,產(chǎn)生大量NO自由基,刺激細(xì)胞凋亡和膠原組織降解,促進(jìn)AS的形成,NO自由基還可與O-2反應(yīng)形成過氧化亞硝酸鹽,引起組織損傷。NOS在AS的發(fā)病機(jī)制方面有著雙重作用:在正常情況下,eNOS催化產(chǎn)生低濃度的NO,這對機(jī)體抗AS是有益的[6-8];然而在高脂血癥、AS時,它通過依賴于四氫生物嘌呤(BH4)途徑而形成超氧化物[9-10]。如果再加上局部iNOS的活化,將會導(dǎo)致粥樣硬化斑塊內(nèi)高濃度的有細(xì)胞毒作用的過氧化亞硝酸鹽形成。最近 Bohr-Roussel、B?ger RH等[11-12]給高膽固醇喂養(yǎng)的兔長期應(yīng)用iNOS特異的抑制劑2周后,發(fā)現(xiàn)AS斑塊、主動脈內(nèi)膜/中膜比例與正常對照組相比無差異,這表明iNOS抑制劑確能限制高膽固醇兔的AS進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,HTGBS組HUVEC中內(nèi)皮依賴性舒張因子NO含量、TNOS活性與正常對照組相比明顯降低(P< 0.01);i-NOS活性與正常對照組相比明顯升高(P<0.01)。初步提示HTGBS可以通過降低TNOS的活性,增加iNOS活性,直接或間接地減少內(nèi)源性NO的合成與釋放。

      HO是血紅素降解起始酶和最為重要的限速酶。它降解血紅素產(chǎn)生CO、膽綠素和鐵離子。HO在人體內(nèi)廣泛存在,參與多種生理和病理過程,與心血管疾病有著密切的聯(lián)系。HO-1源性的CO在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,可通過調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng)的緊張度,發(fā)揮心腦血管保護(hù)作用[13]。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上初步觀察HTGBS所致HUVEC氧化損傷對HO-1/CO系統(tǒng)的影響,Western Blot結(jié)果顯示,與正常對照組比較,HTGBS組HUVEC中HO-1蛋白表達(dá)代償性升高,細(xì)胞培養(yǎng)液中的CO含量明顯增加,實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示,HTGBS損傷的HUVEC中HO-1表達(dá)上調(diào)是細(xì)胞代償性保護(hù)性反應(yīng)。

      綜上所述,HTGBS不僅能降低細(xì)胞的抗氧化能力,增加脂質(zhì)過氧化物的生成損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,代償性上調(diào)細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá),并且可以通過影響NO/NOS系統(tǒng)從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。

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