劉朋軍

（石樓縣動物疫病預(yù)防控制中心，山西 石樓032500）

因此，研究豬肺炎支原體侵染后機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)的變化將有助于對豬支原體肺炎致病性的診斷，有助于在現(xiàn)有基礎(chǔ)上對藥物、疫苗的研制和開發(fā)，為臨床治療豬支原體肺炎提供理論依據(jù)。白細(xì)胞介素（IL－1β）是參與細(xì)胞免疫的重要的細(xì)胞因子，通過對豬肺炎支原體感染后機(jī)體血清中白細(xì)胞介素（IL－1β）的測定，可以測定機(jī)體細(xì)胞免疫的情況，從而進(jìn)一步診斷豬支原體肺炎。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)用無支原體肺炎長白豬8只，由山西省太谷縣振興養(yǎng)豬場提供的斷奶仔豬，體重為6．28～8．54kg，健康狀況良好，飼料由實(shí)驗(yàn)中心自配。

1．2 主要試劑

JM109型豬肺炎支原體，小鼠重組IL－1β凍干標(biāo)準(zhǔn)品，樣品稀釋液，生物素標(biāo)記抗小鼠IL－1β，抗體稀釋液，親和素－過氧化物酶復(fù)合物（ABC），ABC稀釋液，TMB顯色液，TMB終止液等試劑由北京博奧深公司提供。0．01mol·L－1PBS，豬肺炎支原體特異性抗體自制。

在豬60日齡時隨機(jī)分成2組，每組4頭，分別是空白對照組、攻毒組，每頭豬都注射5頭份。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 樣本的采集與處理

在攻毒前采集血液，不作抗凝處理，以備血清學(xué)檢測用。分別于攻毒后第7d、14d、21d時，腹腔靜脈采血，編號，血液不作抗凝處理，2000r·min－1離心10min，將血清裝入EP管，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 檢測指標(biāo)及方法

1．3．2．1 攻毒前血清中豬肺炎支原體的檢測

用定性玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行檢測。取豬肺炎支原體特異性抗體和攻毒前所采血清0．03mL，于載玻片上充分混合，放置3min后判定結(jié)果。

當(dāng)前本校市場營銷專業(yè)建設(shè)的主要特色表現(xiàn)在下列兩個方面：①醫(yī)藥背景突出。本校市場營銷專業(yè)課程體系主要由藥學(xué)課程、營銷類課程、工商管理類課程等組成，其中藥學(xué)課程占相當(dāng)一部分比例。同時借助醫(yī)藥院校自身的背景，擁有醫(yī)藥方面的師資力量、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、圖書資料等，具有先天性優(yōu)勢，這是一般院校難以比擬的。②學(xué)生就業(yè)前景較好。本校醫(yī)藥營銷專業(yè)學(xué)生的就業(yè)率一直以來保持在非常高的水平，就業(yè)率接近100%。

1．3．2．2 血清中IL－1β含量的測定

將 500．0ng·L－1，250．0ng·L－1，以 及125．0ng·L－1，62．5ng·L－1，31．3ng·L－1，15．6ng·L－1，7．8ng·L－1的標(biāo)準(zhǔn)品各0．1mL一次加入一排七孔中，最后一孔只加樣品稀釋液的作為零孔。將準(zhǔn)備好的生物素抗小鼠IL－1β抗體工作液按每孔0．1mL依次加入。37℃反應(yīng)60 min。

將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0．1mL依次加入。37℃反應(yīng)30min。按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30min的TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)20min。按每孔加入0．1mL依次加入TMB終止液，用酶標(biāo)儀在450nm測定OD值。

1．4 數(shù)據(jù)處理

測定結(jié)果用spass16．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 攻毒前血清中豬肺炎支原體的檢測結(jié)果

攻毒前血清中未發(fā)生凝集，說明攻毒前豬體內(nèi)不含豬肺炎支原體。

2．2 各組豬血清白細(xì)胞介素（IL－1β）含量測定結(jié)果

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，攻毒組在三個時間點(diǎn)血清IL－1β含量都高于對照組，攻毒7d、14d、21d后血清IL－1β含量與對照組血清IL－1β含量相比較，差異顯著（P＜0．05）。攻毒組在攻毒14d后血清IL－1β含量高于攻毒7d后血清IL－1β含量，二者差異顯著（P＜0．05）。攻毒組在攻毒14d后血清IL－1β含量高于攻毒21d后血清IL－1β含量，二者差異顯著（P＜0．05）（見表1）。

表1 各組豬血清IL－1β含量測定值／ng·L－1Table 1 Contents of IL－1βin serum in pigs／ng·L－1

3 討論

白細(xì)胞介素－1（interleukin－1，IL－1）包括三個氨基酸序列高度同源的蛋白質(zhì)：IL－1α、IL－1β和IL－1Ra（或IL－1γ）。它是由多種細(xì)胞產(chǎn)生、有多方面生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中有重要作用。眾多的生物學(xué)效應(yīng)使其在免疫系統(tǒng)中成為一種起中心作用的細(xì)胞因子。最近的研究進(jìn)一步從基因水平上揭示出了IL－1與疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系［4］。

Mhp感染的一個特征是大量的免疫粒細(xì)胞在肺組織積聚［5］。一些細(xì)胞因子，包括IL－1，TNF－α和IL－6，已經(jīng)在Mhp感染的豬的呼吸道灌洗液中檢測到［6，7］。TNF－α和IL－1能刺激幾乎所有的炎癥反應(yīng)。由其產(chǎn)生的IL－6是致熱原，能誘導(dǎo)急性期反應(yīng)物的產(chǎn)生。在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和 Mhp共感染中，IL－1α、IL－1β、IL－8和TNF的增加表明，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在支原體肺炎中起重要作用［8，9］。白細(xì)胞介素1與其特異受體結(jié)合后，通過某些調(diào)節(jié)蛋白作用，激活胞膜上或胞漿內(nèi)的多種磷脂酶，產(chǎn)生多種信使類物質(zhì)。此外，近年來還發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素1可激活多種蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。不同傳導(dǎo)途徑的細(xì)胞信號與白細(xì)胞介素1導(dǎo)致的炎癥效應(yīng)密切相關(guān)［10］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明豬肺炎支原體感染后機(jī)體的IL－1β的含量在攻毒后第二周左右達(dá)到最大值，攻毒后到第二周之前IL－1β的含量逐漸升高，第二周之后IL－1β的含量逐漸降低。IL－1β是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的重要因子，隨著Mhp感染的加劇而增加含量，從而進(jìn)一步可預(yù)測其他細(xì)胞因子的含量也會提高，可預(yù)測在豬肺炎支原體侵染機(jī)體后，細(xì)胞免疫系統(tǒng)激活，與體液免疫、黏膜免疫共同作用，提高機(jī)體的抵抗能力。

4 結(jié)論

豬肺炎支原體使白細(xì)胞介素（IL－1β）的含量顯著增強(qiáng)，可以通過檢測IL－1β來判斷是否患有豬肺炎支原體，從而為快速地檢測和診斷豬肺炎支原體提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］畢丁仁，王桂枝．動物霉形體及研究方法 ［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：3－61．

［2］曹玉璞，葉元康．支原體與支原體病 ［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：75－182．

［3］劉青海，車秀華，孫洪升．豬肺炎支原體的研究進(jìn)展［J］．畜牧獸醫(yī)科技信息：2005（6）：12．

［4］劉興，蔣建新，馮文莉．白細(xì)胞介素－1基因多態(tài)性與疾?。跩］．醫(yī)學(xué)綜述：2002，8（2）：63－65．

［5］Asai T，Okada M，Ono M，Irisawa T，et al．Increased levels of tumor necrosis factor and interleukin－1in bronchoalveolar lavage fluids from pigs infected with Mycoplasma hyopneumoniae［J］．Vet．Immunol．Immunopathol，1993，38：253－260．

［6］Asai T，Okada M，Ono M，Mori Y，et al．Detection of interleukin－6and prostaglandin E2in bronchoalveolar lavage fluids of pigs experimentally infected with Mycoplasma hyopnemoniae［J］．Vet．Immunol．Immunopathol，1994，44：97－10．

［7］Kristien V R，Steven V G，Maurice P．In vivo studies on cytokine involvement during acute viral respiratory disease of swine：trouble but rewarding［J］．Vet Immunol and Immunopathol，2002，87：161－168．

［8］Roongroje T，Theresa F Y，Brad J T，et al．Differential production of proinflammatory cytokines：in vitro PRRSV and Mycoplasma hyopneumoniae co－infection model［J］．Vet Immunol and Immunopathol，2001，79：115－127．

［9］夏春芳，霍勇．白細(xì)胞介素10的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo) ［J］．國外醫(yī)學(xué)：免疫學(xué)分冊，2001，24（5）：269－272．

［10］呂根法，張文惠．前列腺素E2抑制 T細(xì)胞活化的機(jī)制 ［J］．免疫學(xué)雜志，2002，18（S1）：224－226．