張晉強(qiáng)，牛麗，宋美琴，白喜云

（1．山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息學(xué)院，山西 太谷030801；2．山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801）

近年來，人們對(duì)病毒的研究越來越深入，包括在細(xì)胞模型上高通量篩選抗病毒藥物并且進(jìn)一步在細(xì)胞水平以及分子水平上研究病毒致病機(jī)制、藥物抗病毒機(jī)制等方面進(jìn)行大量研究［1］。不管是對(duì)病毒進(jìn)行哪方面的研究，確保病毒感染是首要環(huán)節(jié)，而吸附是啟動(dòng)病毒感染的第一步，也是決定病毒感染成功與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究藥物與病毒作用的時(shí)效關(guān)系［2］可以從一定程度闡明藥物的抗病毒機(jī)制，而病毒在細(xì)胞上的吸附時(shí)間的確定對(duì)于闡明藥物的抗病毒機(jī)制具有一定的指導(dǎo)作用。所以，測(cè)定病毒在細(xì)胞上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間對(duì)病毒的研究具有重要的價(jià)值。

病毒吸附細(xì)胞的時(shí)間對(duì)病毒感染細(xì)胞的能力有明顯影響，不同的病毒完成吸附過程所需時(shí)間不等，一般不超過120min，如西方型馬腦炎病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞，其30min的吸附率達(dá)到了85%；狂犬病毒感染BHK－21細(xì)胞，也可在30min內(nèi)完成吸 附［3］。Ⅰ 型IBDV 在雞胚 腎 （Chicken embryo kidney cells，CEK）細(xì)胞上37℃孵育 75 min時(shí)可以達(dá)到病毒的最大吸附量；Ⅰ型和Ⅱ型IBDV接種于Vero上37℃孵育70min時(shí)可以達(dá)到病毒的最大吸附量［4］。但是IBDV在雞胚成纖維細(xì) 胞 （Chicken enbryos fibroblasts，CEF）上、MDV在 CEF上、PRRSV 在 Marc－145上以及PRV在PK－15上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間至今還未見報(bào)道。

本試驗(yàn)將通過觀察病毒在細(xì)胞上吸附不同時(shí)間后產(chǎn)生的細(xì)胞病變情況測(cè)定這4種病毒在細(xì)胞上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞

1．1．1 雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）

取9～11日齡的雞胚，將外部消毒，在超凈臺(tái)內(nèi)小心取出雞胚，放在無菌培養(yǎng)皿中，除去頭部、翅膀及內(nèi)臟；剪切成1～2mm3的小塊體積，用PBS緩沖液洗滌后置于錐形瓶中，加入0．25%胰蛋白酶消化液，于37℃水浴鍋內(nèi)消化，待組織塊呈蓬松茸毛狀時(shí)終止消化，棄去胰酶并加入適量的培養(yǎng)液，用彎頭吸管反復(fù)吹打后經(jīng)200目過濾篩過濾；取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，以1×106個(gè)·mL－1的細(xì)胞密度接種并置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．1．2 細(xì)胞系

Marc－145細(xì)胞（購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）的傳代：棄去培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液，加入適量PBS沖洗后加入1mL胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，輕搖細(xì)胞培養(yǎng)瓶使瓶底細(xì)胞都充分接觸胰酶，37℃消化約2 min，棄去胰酶，加入含有10%FBS的培養(yǎng)液后用吸管將細(xì)胞單層吹打成細(xì)胞懸液，分裝后于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

PK－15細(xì)胞（豬腎細(xì)胞，購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）的傳代于37℃消化約3～4min，其它同Marc－145細(xì)胞。

1．2 病毒

傳染性法氏囊病毒（IBDV）（B87株）疫苗，浙江易邦生物有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為（2007）110572026。將IBDV疫苗毒在雞胚成纖維細(xì)胞上傳代2次，按Reed－Muench法［5］測(cè)定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）備用。

雞馬立克氏病毒（MDV－1）弱毒疫苗，北京翎羽禽病防治技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為XLYB003。將MDV－1型疫苗毒在CEF上傳代2次，測(cè)出其毒力備用。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）（JXAI－R株）疫苗，廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為1012001。將PRRSV疫苗毒在Marc－145細(xì)胞上擴(kuò)增后，按Reed－Muench法測(cè)定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）備用。

豬偽狂犬病毒（Pig pseudo rabies virus，PRV）購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)查所的標(biāo)準(zhǔn)毒株。將毒株在PK－15細(xì)胞上擴(kuò)增后，按Reed－Muench法測(cè)定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）備用。

1．3 試劑

DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品，加入四季青胎牛血清，血清濃度達(dá)到5%的為細(xì)胞培養(yǎng)液、2%為細(xì)胞維持液。按照常規(guī)劑量加入谷氨酰胺和雙抗。胰蛋白酶，用PBS（pH 為7．2～7．4）配制成0．25%的溶液，濾器過濾除菌，分裝后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（SL shellab，USA），倒置顯微鏡（OLYMPUS IX81，Japan），96 孔 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 板（Corning，USA）。

1．5 試驗(yàn)方法

1．5．1 IBDV在CEF上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間的測(cè)定

按照每組4個(gè)重復(fù)，將CEF細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106個(gè)·mL－1后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h，棄掉孔內(nèi)液體，用PBS沖洗3次，按照每孔100μL加入100TCID50的IBDV病毒液，置于培養(yǎng)箱中孵育，分別在孵育15、30、45min、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4、4．5、5h后，將病毒液棄去，PBS沖洗3次后加入新鮮維持液。另設(shè)病毒對(duì)照組（加入病毒液后不做處理）、細(xì)胞對(duì)照組（不加病毒加維持液）。加樣完畢后繼續(xù)培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變情況。當(dāng)病毒對(duì)照出現(xiàn)70%～80%的細(xì)胞病變時(shí)，觀察并記錄試驗(yàn)孔細(xì)胞病變情況。

1．5．2 MDV在CEF上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間的測(cè)定

制備CEF后將細(xì)胞密度調(diào)整至1．5×106·mL－1，按照500μL·孔－1接種于24孔板，置于37℃、5%CO2中培養(yǎng)24h。將 MDV病毒液按照100PFU·孔－1接種于CEF上，分別在孵育15、30、45min、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0、4．5、5．0h后，將病毒液棄去，PBS沖洗3次后加入新鮮維持液。另設(shè)病毒對(duì)照組（加入病毒液后不做處理）、細(xì)胞對(duì)照組（不加病毒加維持液）。加樣完畢120h后觀察細(xì)胞病變情況。

1．5．3 PRRSV 在 Marc－145細(xì)胞上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間的測(cè)定

按照1．5×105·mL－1接種細(xì)胞［6］，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，接種稀釋度為100TCID50的病毒液，100 mL·孔－1，病毒吸附時(shí)間從15min至4．0h。每15min為吸附時(shí)間間隔，每個(gè)時(shí)間間隔接種6孔，棄病毒液，PBS沖洗3次，換2%的維持液于5%CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察CPE情況，待100TCID50病毒對(duì)照組病變達(dá)70%～80%時(shí)，終止試驗(yàn)。

1．5．4 PRV在PK－15細(xì)胞上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間的測(cè)定

按照每組4個(gè)重復(fù)，將PK－15細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×105個(gè)·mL－1后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24．0h，倒掉孔內(nèi)液體，用PBS沖洗3次，按照每孔100μL加入100TCID50的PRV病毒液，置于培養(yǎng)箱中孵育。病毒吸附時(shí)間從15min至4．0h。每15min為吸附時(shí)間間隔，每個(gè)時(shí)間間隔接種6孔，棄病毒液，PBS沖洗3次，換2%的維持液于5%CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察CPE情況，待100TCID50病毒對(duì)照組病變達(dá)70%～80%時(shí)，終止試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 IBDV在CEF上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間的測(cè)定

吸附了15min、30min、45min試驗(yàn)組細(xì)胞病變程度依次增大，但均比病毒對(duì)照組細(xì)胞病變情況輕微；吸附60min及其后面實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞病變與病毒對(duì)照細(xì)胞病變情況相當(dāng)（圖1）；結(jié)果表明IBDV在CEF上37℃孵育60min時(shí)，IBDV的吸附量達(dá)到最大值。

圖1 各組細(xì)胞病變Fig．1 Result of adsorption time of IBDV on CEF

2．2 MDV在CEF上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間的測(cè)定

從吸附15min到120min的試驗(yàn)孔，病變?cè)絹碓街?，?20min時(shí)達(dá)到峰值，之后不再加深。所以MDV在CEF上37℃孵育120min時(shí)，MDV的吸附量達(dá)到最大值。

2．3 PRRSV在Marc－145上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間的測(cè)定

當(dāng)100TCID50對(duì)照組的病變達(dá)到70%～80%時(shí)：吸附時(shí)間從15min到60min細(xì)胞病變程度遞增但均未達(dá)到100TCID50對(duì)照組病變程度。吸附時(shí)間為60min時(shí)，細(xì)胞病變程度與病毒對(duì)照一致。最終確定病毒的最佳吸附時(shí)間為60min。

2．4 2．4 PRV在PK－15細(xì)胞上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間的測(cè)定

吸附時(shí)間從15min到60min細(xì)胞病變程度隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，但均未達(dá)到病毒對(duì)照組病變程度。吸附時(shí)間大于60min時(shí)，細(xì)胞病變程度與病毒對(duì)照一致，所以確定病毒的最佳吸附時(shí)間為60min。孵育75min時(shí)可以達(dá)到病毒的最大吸附量，Ⅰ型和Ⅱ型IBDV接種于Vero上37℃孵育70min時(shí)可以達(dá)到病毒的最大吸附量。本實(shí)驗(yàn)中37℃條件下孵育測(cè)得IBDV病毒在CEF上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間為60min。與之前報(bào)道出現(xiàn)略微差異可能是因?yàn)樵囼?yàn)所選用的細(xì)胞與之前報(bào)道試驗(yàn)所用細(xì)胞不同以及所用病毒與報(bào)道試驗(yàn)所用病毒不同而造成。

有文章報(bào)道PRV在Vero細(xì)胞上所需吸附時(shí)間為1h［6］，在 PK 細(xì)胞上吸附1．5h［7］，PRRSV NVDC－JXA1株在 Marc－145上吸附30min［8］，可能由于實(shí)驗(yàn)條件、試驗(yàn)所用細(xì)胞系以及病毒毒株等差異造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有不符；MDV在CEF上吸附2h［9］。本試驗(yàn)測(cè)定 MDV在CEF上達(dá)到最大吸附量所需時(shí)間為120min與報(bào)道相符。

在本試驗(yàn)中，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)孔病變加重；到一定時(shí)間后病變程度不再隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，說明病毒吸附量已經(jīng)達(dá)到最大值。不同的病毒完成吸附細(xì)胞的時(shí)間不等，一般不超過120min［3］。

3 討論

之前有報(bào)道Ⅰ型IBDV在雞胚腎細(xì)胞上37℃

［1］羅俊，滕蔓，樊劍鳴，等．雞傳染性法氏囊病病毒在 DT40細(xì)胞中的增殖規(guī)律［J］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，40（8）：1276－1280．

［2］Salim MT，Goto Y，Hamasaki T，Okamoto M，Aoyama H，Hashimoto Y，Musiu S，Paeshuyse J，Neyts J，F(xiàn)roeyen M，Herdewijn P，Baba M．Highly potent and selective inhibition of bovine viral diarrhea virus replication byγ－carboline derivatives［J］．Antiviral Research，2010，88：263－268．

［3］徐耀先，周曉峰，劉立德．分子病毒學(xué)［M］．武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2000：67－159．

［4］黃金海，李健強(qiáng)．傳染性法氏囊病病毒在細(xì)胞中的增殖及其分子機(jī)制［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，1999，20（2）：20－24．

［5］胡元亮，劉國(guó)家，陳玉庫，等．中藥成分對(duì)傳染性法氏囊病毒感染細(xì)胞的影響［J］．畜牧與獸醫(yī)，2003，35（12）：8－10．

［6］Iwata K，Naito E，Yamashita K，et al．Takase K ．Anti pseudorabies virus activity of kumazasa extract［J］．Biocontrol Science，2010，15（4）：123－128．

［7］仇微紅，張盼鋒，李雪，等．大青葉板藍(lán)根等5種清熱類中藥體外抗偽狂犬病病毒效果［J］．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（11）：37－39．

［8］朱文革，賀云霞，周振成，等．PRRSV NVDC－JXAl株在 Marc－145細(xì)胞上增殖條件的優(yōu)化［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（6）：66－69．

［9］褚秀玲，蘇建青．細(xì)胞病變觀察法檢測(cè)人參皂苷及其衍生物抗馬立克氏病病毒的作用［J］．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（3）：170－183．