• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看

      ?

      清熱化瘀方對腦缺血再灌注大鼠GDNF mRNA及其蛋白表達的影響1)

      2011-09-14 09:25:30胡躍強劉尊敬祝美珍胡玉英范立雷
      關(guān)鍵詞:暗帶光密度化瘀

      胡躍強,唐 農(nóng),劉 泰,劉尊敬,祝美珍,胡玉英,范立雷

      腦缺血損傷后,除了存在一種主動性的程序性細胞死亡(凋亡)過程,在耐受細胞內(nèi)還存在一種平行的主動性神經(jīng)元存活過程,而神經(jīng)營養(yǎng)因子就參與了這種主動性神經(jīng)元存活過程。膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)是轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員,是一個最有效的營養(yǎng)因子[1],對多種神經(jīng)元具有營養(yǎng)作用。它有促進多巴胺能神經(jīng)元的存活,促進神經(jīng)元軸突的定向生長以及促進運動神經(jīng)元損傷修復(fù)和神經(jīng)再生等作用。本實驗通過研究清熱化瘀方對腦缺血后GDNF mRNA及其蛋白表達的影響,以探討腦缺血后GDNF的表達變化規(guī)律及清熱化瘀方治療腦缺血的腦保護作用機制。

      1 材料與方法

      1.1 動物分組及處理 SD大鼠96只,雌雄各半,體重250g±20g,隨機分為正常對照組(A組)、假手術(shù)組(B組)、模型組(C組)和清熱化瘀組(D組),后3組按處死時間分為術(shù)后3h、6h、12h、24h、3d、7d6個時間點,每個時間點5只動物。正常組大鼠不處理;假手術(shù)組線栓只插入頸內(nèi)動脈9mm,使大腦中動脈起始部不致阻塞;模型組造模后灌胃等體積的生理鹽水;清熱化瘀組動物造模后,以清熱化瘀湯(由水牛角、丹參、赤芍、地龍、石菖蒲等10味中藥組成)14g/(kg·d)灌胃。各組均在術(shù)前6 h灌胃一次,且6h、12h、24h、3d、7d時間點的動物在手術(shù)后清醒時開始灌胃,每天上、下午各一次,每次1.4mL/100g大鼠,其濃度及等效劑量按體表面積折算。

      1.2 動物模型制作 參考Longa的線栓法制備局灶性大腦中動脈腦缺血模型。試驗過程和動物蘇醒期間,保持動物的體溫正常。

      1.3 組織處理 將大鼠常規(guī)麻醉后,經(jīng)左心室先后用生理鹽水和4%的多聚甲醛進行灌注。然后取腦組織固定、脫水、石蠟包埋,按4μm厚度連續(xù)切片。

      1.4 缺血半暗帶腦皮質(zhì)GDNF mRNA表達測定 原位雜交法,按試劑盒說明進行操作。

      1.5 缺血半暗帶腦皮質(zhì)GDNF蛋白表達測定 免疫組化法。切片以1%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶,滴加正常山羊血清封閉液室溫下孵育30min,接著分別滴加1∶100稀釋的小鼠抗大鼠GDNF單克隆抗體(Santa Cruz,USA),4℃過夜,然后以PBS洗滌。再滴加1∶100的二抗生物素化兔IgG(武漢博士德),PBS沖洗,切片以ABC試劑盒,按廠家說明進行處理。

      1.6 結(jié)果觀察 在生物光學(xué)顯微鏡下觀察腦缺血周圍區(qū)的GDNF的陽性神經(jīng)元,采用HPIAS-1000彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行分析,測定原位雜交和免疫組化陽性細胞染色的光密度(OD)值。每張切片測定4個視野(×400),取平均值作為測定值。

      2 結(jié) 果

      2.1 缺血半暗帶GDNF mRNA的表達變化 原位雜交顯示,正常對照組與假手術(shù)組可檢測到極弱的GDNF mRNA陽性染色細胞,腦缺血再灌注后3h其頂葉皮層表達水平開始增高(P<0.05),6h達到高峰(P<0.05),12h表達開始減弱(P<0.05),3d后降至正常水平;清熱化瘀組其表達信號在缺血再灌注后3h、6h、12h、1d明顯強于模型組。詳見表1。

      表1 各組大鼠GDNFmRNA表達的光密度值比較(±s)

      表1 各組大鼠GDNFmRNA表達的光密度值比較(±s)

      組別 3h 6h 12h 24h 3d 7d A組0.202±0.042 B組 0.210±0.049 0.206±0.060 0.195±0.054 0.198±0.046 0.211±0.048 0.213±0.058 C組 0.248±0.0641) 0.369±0.0661)2) 0.320±0.0601) 0.264±0.0531) 0.225±0.062 0.204±0.059 D組 0.272±0.0573) 0.398±0.0753) 0.357±0.0643) 0.302±0.0653) 0.233±0.061 0.218±0.063與B組和A組比較,1)P<0.05;與其他時間點比較,2)P<0.05;與C組比較,3)P<0.05

      2.2 缺血半暗帶GDNF蛋白的表達變化 正常對照組與假手術(shù)組可檢測到較弱的GDNF蛋白染色陽性細胞,腦缺血再灌注后3h其頂葉皮層表達水平開始增高(P<0.05),6h達到高峰(P<0.05),12h表達開始減弱(P<0.05),3d后降至正常水平;清熱化瘀組其表達信號在缺血再灌注后3h、6h、12h、1d三個時間點明顯強于模型組。詳見表2。

      表2 各組大鼠GDNF蛋白表達的光密度值比較(±s)

      表2 各組大鼠GDNF蛋白表達的光密度值比較(±s)

      組別 3h 6h 12h 24h 3d 7d A組0.162±0.038 B組 0.154±0.036 0.165±0.040 0.158±0.037 0.159±0.039 0.160±0.042 0.167±0.049 C組 0.183±0.0481) 0.236±0.0591)2) 0.201±0.0551) 0.190±0.0451) 0.176±0.054 0.162±0.036 D組 0.216±0.0603) 0.273±0.0703) 0.237±0.0653) 0.225±0.0563) 0.192±0.045 0.178±0.052與B組和A組比較,1)P<0.05;與其他時間點比較,2)P<0.05;與C組比較,3)P<0.05

      3 討 論

      GDNF是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員,具有多種重要的生物學(xué)活性,不僅特異性地促進多巴胺能神經(jīng)元的存活,還對外周神經(jīng)系統(tǒng)及非神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛的作用。在胚胎發(fā)育過程中GDNF促進神經(jīng)元的存活、軸突的生長、控制神經(jīng)元的分化、調(diào)節(jié)突觸傳遞。此外,GDNF可減少神經(jīng)變性疾病中神經(jīng)元的變性壞死,同時也是該類疾病基因治療的候選神經(jīng)營養(yǎng)因子之一。

      腦缺血損傷后,GDNF表達增加,以抑制遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。在大鼠MCAO模型中,缺血30min再灌1h誘導(dǎo)GDNF表達,3h達高峰,24h后明顯減少,在再灌注72h后其表達出現(xiàn)第二次高峰[2]。Miyazaki等[3]報道短暫前腦缺血后,海馬GDNF的受體Ret表達升高,12h達高峰,給予GDNF腦室注射可顯著減少海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。腦缺血后GDNF蛋白及受體的表達上調(diào)可能在腦缺血損傷后腦保護中起著重要的作用。GDNF對腦缺血后的神經(jīng)保護作用可能是通過以下幾條途徑來實現(xiàn)的:①抑制腦缺血損傷后半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-1、3的表達,減少神經(jīng)元凋亡[4];②減輕腦缺血后腦水腫[5];③GDNF可減少NO的合成與釋放,通過抑制神經(jīng)元型NOS活性而發(fā)揮腦保護作用[6]。

      腦梗死是臨床危重急癥之一,腦缺血后,引起多種炎癥反應(yīng)因子以及興奮性氨基酸大量釋放,激活NMDA受體,引起缺血級聯(lián)反應(yīng),同時上述損傷也激活了神經(jīng)元的自我保護機制。由于GDNF是蛋白質(zhì),不能通過血腦屏障,所以增加內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的治療手段顯得尤為重要,中藥作為體內(nèi)微環(huán)境的調(diào)節(jié)劑,可能在此方面具有重要的作用。依據(jù)“毒邪致病”理論而設(shè)的清熱化瘀方由水牛角、丹參、川芎、地龍等中藥制成,其功能為清熱祛風(fēng)化痰、活血化瘀通絡(luò)、利水消腫,是治療腦梗死的有效方劑,一系列研究表明其通過不同途徑對腦缺血損傷組織具有保護作用,作為腦神經(jīng)功能保護劑在臨床運用有較好的療效[7-9]。

      本研究從神經(jīng)營養(yǎng)因子的角度進一步研究清熱化瘀方對腦缺血損傷的保護作用。結(jié)果表明,缺血半暗帶GDNF mRNA及其蛋白均在腦缺血后3h出現(xiàn)明顯表達,6h表達達到高峰,以后逐漸降低。提示清熱化瘀方可能通過上調(diào)腦缺血后GDNF mRNA及蛋白的表達水平,從而保護受損神經(jīng)元。

      [1]Saarma M,Sariola H.Other neurotrophic factors:Glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)[J].Microsc Res Tech,1999,45(4-5):292-302.

      [2]Wei G,Wu G,Cao X.Dynamic expression of glial cell line-derived neurotrophic factor after cerebral ischemia[J].Neuro Report,2000,11(6):1177-1183.

      [3]Miyazaki H,Nagashima K,Okuma Y,etal.Expression of ret receptor kinase after transient forebrain ischemia is modulated by glial cell line-derived neurotrophic factor in rat hippocampus [J].Neurosci Lett,2002,318(1):1-4.

      [4]Yu LY,Saarma M,Arum?e U.Death receptors and caspases but not mitochondria are activated in the GDNF-or BDNF-deprived dopaminergic neurons[J].J Neurosci,2008,28(30):7467-7475.

      [5]Chen B,Gao XQ,Yang CX,etal.Neuroprotective effect of grafting GDNF gene-modified neural stem cells on cerebral ischemia in rats[J].Brain Res,2009,1284:1-11.

      [6]Lin SZ,Chiou AL,Wang Y.Keramine antagonizers nitric oxide release from cerebral cortex after middle cerebral artery ligation in rats[J].Stroke,1996:27:747-752.

      [7]胡國恒,龍華君,陳北陽,等.清熱化瘀方預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2006,26(2):7-9.

      [8]胡躍強,胡國恒,吳云虎,等.清熱化瘀顆粒治療急性腦梗死臨床觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志,2003,20(7):65-67.

      [9]吳云虎,葉萍,胡躍強.清熱化瘀顆粒對局部腦缺血模型海馬內(nèi)IL-1β及ICAM-1的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,13(16):2133-2135.

      猜你喜歡
      暗帶光密度化瘀
      3D pCASL不同標(biāo)記后延遲時間評估急性缺血性腦卒中缺血半暗帶體積時相對腦血流量閾值的選擇
      3 種角膜光密度評估近視Trans-PRK術(shù)后haze的比較
      Huoxue Jiedu Huayu recipe (活血解毒化瘀方) alleviates contralateral renal fibrosis in unilateral ureteral obstruction rats by inhibiting the transformation of macrophages to myofibroblast
      補虛解毒化瘀方治療慢性萎縮性胃炎的隨機對照試驗
      病理輔助診斷系統(tǒng)中數(shù)字濾光片的實現(xiàn)方法
      DWI聯(lián)合DTI技術(shù)對早期腦梗死缺血半暗帶的評估價值
      重視急性腦梗死后缺血半暗帶的臨床評估和治療
      HPLC法同時測定化瘀祛斑膠囊中4種成分
      中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:04
      小麥種子活力測定方法的比較
      應(yīng)用數(shù)字圖像技術(shù)測量炮口火焰的方法研究
      陇川县| 大关县| 邻水| 西城区| 仲巴县| 安塞县| 泰宁县| 景德镇市| 阳东县| 江西省| 青阳县| 海淀区| 宁阳县| 丹棱县| 岑溪市| 扎囊县| 金坛市| 夏邑县| 尚义县| 松潘县| 寻乌县| 全椒县| 藁城市| 济南市| 丰都县| 扶沟县| 江城| 富宁县| 天水市| 凭祥市| 南江县| 西宁市| 易门县| 泰兴市| 洪雅县| 南昌县| 谢通门县| 新平| 志丹县| 任丘市| 光山县|