高宏偉，匡海學(xué)，閻雪瑩

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

Picroliv為印度胡黃連活性成分胡黃連苦苷Ⅰ(picrosideⅠ，P－Ⅰ)、胡黃連苷制成的標(biāo)準(zhǔn)化制劑。對(duì)四氯化碳、硫代乙酰胺、單響尾蛇毒蛋白、土霉素及半乳糖胺等物質(zhì)引起的肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，其中P－Ⅰ既可以對(duì)抗補(bǔ)體介導(dǎo)的肝細(xì)胞毒，又可對(duì)抗四氯化碳引導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性［1］。

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠在體腸吸收模型，建立了HPLC法測(cè)定腸循環(huán)液中P－Ⅰ的經(jīng)時(shí)濃度，對(duì)其在大鼠各腸段的吸收動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行初步研究，為其提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

胡黃連苦苷Ⅰ(含量97.96%，本實(shí)驗(yàn)室提取分離制得，經(jīng)光譜及核磁共振圖譜鑒定結(jié)構(gòu));烏拉坦(中國(guó)上海曹陽(yáng)第二中學(xué)化工廠);苯酚紅(天津市新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心);甲醇(色譜純，美國(guó)Dikma公司);其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

LC－2010AHT型高效液相色譜儀(島津公司);Class－VP 6.0工作站(島津公司);Sartorius BT25S電子天平(德國(guó)Sartorius公司);HJ－6A型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);HL－3恒流泵(上海精科實(shí)業(yè)有限公司);pH計(jì)(梅特勒－托利多儀器上海有限公司);722型spectrum可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供(許可證號(hào):SCXK(黑)2008004)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Krebs－Ringers腸循環(huán)灌流液的配制

NaCl(6.75g/L)，KCl(0.31g/L)，CaCl2(0.37g/L)，NaH2PO4(0.22g/L)，MgSO4·7H2O(0.29g/L)，NaHCO3(1.83g/L)，Glucose(2.2g/L)，上述物質(zhì)溶解在雙蒸水中，調(diào)溶液pH值為7.4。

2.2 腸循環(huán)灌流液中酚紅的含量測(cè)定

2.2.1 專屬性考察

取腸循環(huán)灌流液 0.5mL，加 4.5mLNaOH(0.2mol/L)，以不加酚紅的灌流液為空白，使用756型可見(jiàn)分光光度計(jì)，分別于200nm～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，酚紅在558nm處有最大吸收，P－Ⅰ的最大吸收波長(zhǎng)為282nm，表明酚紅與P－Ⅰ不產(chǎn)生干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 腸循環(huán)灌流液光譜掃描圖

2.2.2 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱定酚紅6.25mg，用空白循環(huán)灌流液定容至25mL，分別取 0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mL 定容至25mL，使酚紅的終濃度為 5、10、20、40、60、80μg/mL，取上述不同濃度的酚紅溶液各0.5mL，加入4.5mL NaOH(0.2mol/L)溶液顯色，立即于558nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A與酚紅濃度C(μg/mL)進(jìn)行回歸，得酚紅測(cè)定的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線為:A=0.017 5C+0.042 2，相關(guān)系數(shù) r=0.999 3。

2.3 腸循環(huán)灌流液中P－Ⅰ的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18(5μm，250mm ×4.6mm);偶聯(lián)Dikma EasyGuard II C18保護(hù)柱;流動(dòng)相:甲醇:水(45∶55);檢測(cè)波長(zhǎng):282nm;流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:35℃;靈敏度:0.2AUFS。

2.3.2 P － Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱定P－Ⅰ2.52mg，用經(jīng)過(guò)腸循環(huán)2h的K氏液定容至 25mL，按倍數(shù)稀釋成 0.504、5.04、25.2、50.4、75.6、100.8μg/mL 一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，在上述條件下進(jìn)樣20μL，所得峰面積與濃度進(jìn)行線性回歸，得到P－Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=22 213x－12 576，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。

2.3.3 P－Ⅰ在空白K氏液中的穩(wěn)定性考察

分別取P－Ⅰ適量，用空白灌流液稀釋至不同濃度，置37℃水浴中，并不斷攪拌，分別于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算濃度，考察其在空白灌流液中的穩(wěn)定性，表明對(duì)照品溶液在配制后3h內(nèi)測(cè)定是穩(wěn)定的。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 大鼠在體腸循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)

選取健康合格Wistar大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h，實(shí)驗(yàn)時(shí)10%烏拉坦10mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥，固定于小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，沿腹中線打開(kāi)腹腔，結(jié)扎膽總管。分別選取十二指腸(距離胃的幽門1.5cm處開(kāi)始 15cm)，空腸(距離胃的幽門 25cm處開(kāi)始15cm)、回腸部位(距離盲腸上行長(zhǎng)15cm)作為腸循環(huán)灌流部位。在選定腸段兩端剪開(kāi)小口，分別插入軟管，扎緊，連接蠕動(dòng)泵，使“腸段－軟管－泵”形成一個(gè)閉合回路。開(kāi)啟恒流蠕動(dòng)泵，用空白的Krebs－Ringers灌流液(不加酚紅和測(cè)試藥物)清洗腸腔至流出液清澈無(wú)臟物，泵入空氣排凈管中液體，然后泵入藥液(37℃水浴并攪拌)，灌流速度為2mL/min，循環(huán)10min后從儲(chǔ)液灌中取樣3ml開(kāi)始計(jì)時(shí)定為0點(diǎn)，以后每30min取腸循環(huán)灌流液，按照“2.2項(xiàng)及2.3項(xiàng)”，測(cè)定酚紅和P－Ⅰ濃度，分析藥物的吸收情況。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)胡黃連苦苷Ⅰ腸循環(huán)灌流十二指腸、空腸、回腸的實(shí)驗(yàn)數(shù)值，計(jì)算剩余藥量，見(jiàn)表2。

表1 P－Ⅰ在空白灌流液中的穩(wěn)定性考察(n=7)

表2 P－Ⅰ腸循環(huán)灌流的剩余藥量(M±SD，n=5，mg)

剩余藥量對(duì)數(shù)值與取樣時(shí)間進(jìn)行回歸，得到線性方程，該方程斜率的絕對(duì)值即為吸收速率常數(shù)Ka(h－1)［2］，各方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表3 胡黃連苦苷Ⅰ小腸吸收速率常數(shù)(n=5)

由表3可以看出，P－Ⅰ在大鼠小腸吸收速率大小順序?yàn)?空腸＞十二指腸＞回腸，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及兩兩組間t檢驗(yàn)，結(jié)果十二指腸、空腸、回腸的吸收速率均無(wú)顯著性差異，表明P－Ⅰ在大鼠小腸中并無(wú)特異的吸收部位;根據(jù)以剩余藥量的對(duì)數(shù)對(duì)取樣時(shí)間進(jìn)行線性回歸方程中的相關(guān)系數(shù)r均大于0.9，表明藥物濃度在腸道各部位的下降與循環(huán)時(shí)問(wèn)呈線性關(guān)系，提示P－Ⅰ在大鼠小腸中吸收屬于動(dòng)力學(xué)為一級(jí)吸收。

胡黃連苦苷Ⅰ大鼠腸吸收動(dòng)力學(xué)的相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表4。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［3］，大鼠表觀滲透系數(shù) Papp＜0.03×10－4cm/s和 ＞0.2×10－4cm/s時(shí)，分別表示藥物難以吸收和易于吸收，由表4可以看出，P－Ⅰ在十二指腸、空腸、回腸中的Papp分別為4.97×10－7cm/s，6.29 ×10－7cm/s，3.24 ×10－7cm/s，提示 P － Ⅰ在腸道中難以被吸收。

表4 胡黃連苦苷Ⅰ大鼠腸吸收動(dòng)力學(xué)的參數(shù)(M±SD，n=5)

4 討論

小腸是口服制劑的主要部位，研究表明，鼠小腸吸收模型與人類小腸吸收模型相似，用大鼠小腸吸收模型所得的數(shù)據(jù)能夠有效應(yīng)用于人類小腸的預(yù)測(cè)［4］。

本文采用單向灌流對(duì)P－Ⅰ的腸吸收進(jìn)行了研究，腸段的灌流方法基于灌流前后腸腔內(nèi)藥物濃度的變化，由于小腸不僅吸收藥物，同時(shí)也吸收或分泌水分導(dǎo)致灌流液的體積變化，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定苯酚紅的濃度進(jìn)行校正。

P－Ⅰ在結(jié)構(gòu)上屬于環(huán)烯醚萜糖苷類化合物，性質(zhì)不穩(wěn)定，但其確有保肝利膽的藥理作用。實(shí)驗(yàn)顯示其幾乎不被吸收，這就提示我們P－Ⅰ起效的可能不是原型藥物，而可能是其在腸道中的代謝產(chǎn)物，具體其在體內(nèi)的代謝行為還有待于進(jìn)一步研究。

［1］ 閻雪瑩，刁磊，唐曉飛，高宏偉，等.胡黃連提取物的含量測(cè)定及其肝保護(hù)作用［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37(6):13 －15.

［2］ 唐燦.中藥腸吸收動(dòng)力學(xué)的研究－燈盞花素腸吸收動(dòng)力學(xué)的研究［D］.成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文，2004:29－31.

［3］ Fagerholm U，Johansson M，Lennernas H.Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum［J］.Pharmes，1996，13(9):336－342.

［4］ 程錦，狄留慶.在體腸段灌流模型在中藥吸收研究中的應(yīng)用［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2008，15(2):98－100.