林燕環(huán)，魏 芳，葉冰瑩，張積森，陳由強(qiáng)

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部甘蔗遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108)

可再生生物能源能夠替代不可再生能源，支持可持續(xù)發(fā)展的能源，具有重大現(xiàn)實(shí)意義。目前隨著能源危機(jī)的加劇，在產(chǎn)業(yè)規(guī)模方面發(fā)展最快的是燃料乙醇[1]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是乙醇發(fā)酵的主要菌種[2]。因此獲得乙醇高產(chǎn)菌株是其發(fā)展方向。在釀酒酵母中與乙醇代謝相關(guān)的乙醇脫氫酶由ADH1－ADH5編碼，其中ADH2催化乙醇氧化為乙醛，其他4個(gè)編碼基因催化乙醛還原成乙醇[3－5]。在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)葡萄糖被消耗完后，ADH2開始催化利用乙醇作為碳源[6]。因此，破壞ADH2催化的乙醇分解代謝反應(yīng)，提高釀酒酵母合成乙醇的能力是可行的。目前主要利用基因敲除技術(shù)敲除ADH2基因，一些研究表明ADH2基因敲除突變株遺傳穩(wěn)定性差[2]。本文利用重疊延伸PCR方法，構(gòu)建了釀酒酵母ADH2基因沉默的表達(dá)載體，以期獲得高產(chǎn)的乙醇突變株并能克服遺傳穩(wěn)定差的缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌種及質(zhì)粒載體

工業(yè)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和大腸桿菌DH5α由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)部甘蔗生理遺傳開放重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。pUG6和表達(dá)載體pYES2.0由福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心惠贈(zèng)。

1.2 酶和主要試劑

高保真酶、rTaq酶、T4DNA連接酶、KpnⅠ和NotⅠ均購(gòu)于Takara公司。凝膠純化試劑盒購(gòu)自Promega公司。PCR引物由上海生工公司合成。DNA測(cè)序由TAKARA公司完成。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)重疊延伸PCR的原理設(shè)計(jì)引物[7]，合成以下2對(duì)引物。(1)P1:5'-CGGGGTACCAGCTACAAAAAGCATACAATCAACT-3'，P2:5'-GCGTACGAAGCTTCAGCTGGCCCTTAACGTTTTCACCCATGCCG-3';(2)F1:5'-CAGCTGAAGCTTCGTACGC-3'，F(xiàn)2:5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3'。

其中P1引物為5'UTR序列前25個(gè)堿基，且在5'端引入KpnⅠ的酶切位點(diǎn);P2引物中5'端前19個(gè)堿基與Kanr基因序列前19個(gè)堿基互補(bǔ);F1引物為Kanr基因序列前19個(gè)堿基;F2引物與Kanr基因序列3'端23個(gè)堿基互補(bǔ)，并在5'端引入NotⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。

1.4 重疊延伸PCR擴(kuò)增沉默組件

該沉默組建需要3個(gè)PCR反應(yīng)來(lái)完成。首先以釀酒酵母Y01基因組為模板，P1、P2為上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增ADH2基因的5'UTR(PCR1)，同時(shí)以質(zhì)粒PUG6為模板，F(xiàn)1、F2為上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增KanMX(PCR2)。PCR1、PCR2的反應(yīng)用高保真酶，按標(biāo)準(zhǔn)方法以50 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，將 PCR1、PCR2的產(chǎn)物按照膠回收試劑盒推薦方法進(jìn)行純化回收。然后取PCR1的純化產(chǎn)物1 μL，PCR2的純化產(chǎn)物0.4 μL為模板，以P1、F2為上下游引物，進(jìn)行第3個(gè)PCR(PCR3)。通過(guò)第3個(gè)PCR，用外側(cè)引物將 片段5'UTR和KanMX完成拼接。具體的擴(kuò)增程序參照表1。

表1 PCR反應(yīng)條件Table1 PCR reaction conditions

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過(guò)KpnⅠ、NotⅠ分別將空表達(dá)載體pYES2.0和插入片段雙酶切，連接獲得表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建圖1。

圖1 釀酒酵母表達(dá)載體pSADH2構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of the silencing expression vector

1.6 ADH2基因沉默表達(dá)載體pSADH2的構(gòu)建與鑒定

將上述PCR3擴(kuò)增得到的重疊延伸PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。將鑒定為正確的片段膠回收純化后，用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切，回收約1942 bp的片段，與經(jīng)KpnⅠ和NotⅠ雙酶切純化的表達(dá)載體pYES2.0過(guò)夜連接;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐青霉素的LB平板。挑取白色菌落，37℃ 200 r·min－1搖菌過(guò)夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)一步用酶切和測(cè)序鑒定。陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pSADH2。

2 結(jié)果

2.1 PCR

分別用引物P1、P2和F1、F2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ADH2基因的5'UTR基因和KanMX基因。然后，以這2個(gè)片段為模板，以P1、F2為引物重疊延伸PCR獲得融合片段。電泳結(jié)果(圖2)表明，PCR擴(kuò)增出5'UTR基因、KanMX基因及其融合片段與預(yù)期的理論值大小相符，可用于后續(xù)的研究。

2.2 ADH2基因沉默表達(dá)載體pSADH2的鑒定

新構(gòu)建的沉默表達(dá)載體pSADH2共7797 bp，以pYES2.0為載體，帶有沉默ADH2基因以及G418的抗生素標(biāo)記基因，可以用G418來(lái)篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌株。

提取構(gòu)建的沉默表達(dá)載體pSADH2質(zhì)粒DNA，根據(jù)其多克隆位點(diǎn)進(jìn)行酶切鑒定，用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ分別對(duì)其單酶切和雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis pattern of PCR product

圖3 pSADH2質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis pattern of the plasmid pSADH2 digested by restriction digestion

2.3 ADH2基因沉默表達(dá)載體pSADH2的序列測(cè)序鑒定

提取構(gòu)建的沉默表達(dá)載體pSADH2質(zhì)粒DNA測(cè)序結(jié)果(圖4)與pUG6上KanMX基因與ADH2的5'UTR序列完全相符。通過(guò)以上結(jié)果分析，構(gòu)建的ADH2沉默表達(dá)載體pSADH2結(jié)構(gòu)正確，可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

3 討論

本研究采用重疊延伸PCR成功構(gòu)建了釀酒酵母ADH2基因沉默表達(dá)載體。重疊延伸PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，不僅可以應(yīng)用于擴(kuò)增長(zhǎng)片段基因、定點(diǎn)突變和基因敲除等，而且在定點(diǎn)突變上的應(yīng)用具有突變效率高、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)[8]，但仍存在一些需要解決的問(wèn)題。由于延伸獲得的片段是經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的，因此拼接的準(zhǔn)確性一定程度上受PCR反應(yīng)保真度的影響，并且該技術(shù)操作過(guò)程中很大一部分靠經(jīng)驗(yàn)的指導(dǎo)，并沒有標(biāo)準(zhǔn)的操作條件，對(duì)擴(kuò)增未知序列仍然有一定的困難。

圖4 測(cè)序結(jié)果Fig.4 The result of sequence

pYES2.0質(zhì)粒是釀酒酵母穿梭載體，自身帶有GAL1啟動(dòng)子、URA3和Amp抗性標(biāo)記基因便于篩選。pYES2.0質(zhì)粒屬于非整合型載體，插入片段需帶有啟始編碼子和終止子，含有多個(gè)克隆位點(diǎn)便于外源片段的插入，目前廣泛運(yùn)用于釀酒酵母內(nèi)重組蛋白的表達(dá)。經(jīng)酶切及序列分析可知，本研究已成功構(gòu)建了釀酒酵母ADH2基因沉默表達(dá)載體pSADH2，可以進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)化釀酒酵母及表達(dá)量的研究。

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