無機(jī)碳源對(duì)小球藻自養(yǎng)產(chǎn)油脂的影響

鄭洪立，高振，張齊，黃和,3，紀(jì)曉俊，孫洪磊，竇暢

1 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 210009

2 南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，南京 210009

3 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009

4 中國(guó)石油天然氣股份有限公司石油化工研究院，北京 100029

無機(jī)碳源對(duì)小球藻自養(yǎng)產(chǎn)油脂的影響

鄭洪立1，高振2，張齊1，黃和1,3，紀(jì)曉俊1，孫洪磊4，竇暢1

1 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 210009

2 南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，南京 210009

3 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009

4 中國(guó)石油天然氣股份有限公司石油化工研究院，北京 100029

旨在研究小球藻利用無機(jī)碳自養(yǎng)產(chǎn)油脂，考察了3種無機(jī)碳源 (Na2CO3、NaHCO3和CO2) 及其初始濃度對(duì)小球藻產(chǎn)油特性的影響。結(jié)果表明，小球藻能利用Na2CO3、NaHCO3和CO2產(chǎn)油；經(jīng)Na2CO3、NaHCO3和CO2培養(yǎng)10 d后，隨著每種無機(jī)碳源濃度的增加，小球藻產(chǎn)量均先增加后減少。小球藻經(jīng)3種無機(jī)碳源培養(yǎng)后，其培養(yǎng)液pH值上升。最適宜的Na2CO3和NaHCO3添加量均為40 mmol/L，其生物量分別達(dá)到0.52 g/L和0.67 g/L，產(chǎn)油量分別達(dá)到0.19 g/L和0.22 g/L。在3種無機(jī)碳源中，CO2是最佳無機(jī)碳源，當(dāng)CO2濃度為6%時(shí)，小球藻生長(zhǎng)最快，生物量達(dá)2.42 g/L，產(chǎn)油量最高達(dá)0.72 g/L；當(dāng)CO2濃度過低時(shí)，無機(jī)碳供應(yīng)不足，油脂產(chǎn)量低；當(dāng)CO2濃度過高時(shí)，培養(yǎng)液pH偏低，小球藻油脂積累受到抑制。Na2CO3和NaHCO3較CO2更有利于小球藻積累不飽和脂肪酸。

小球藻，自養(yǎng)，無機(jī)碳，生物柴油

Abstract:We studied the effects of three inorganic carbon sources, Na2CO3, NaHCO3and CO2, and their initial concentrationson lipid production of Chlorella vulgaris. Chlorella vulgaris could utilize Na2CO3, NaHCO3and CO2to produce lipids. After 10-day cultivation with each of the three inorganic carbon sources, lipid yield of Chlorella vulgaris reached its peak with the concentration increase of the inorganic carbon source, but dropped again by further increase of the concentration. The pH value of the culture medium for Chlorella vulgaris increased after the cultivation on inorganic carbon source. The optimal concentration of both Na2CO3and NaHCO3was 40 mmol/L, and their corresponding biomass dry weight was 0.52 g/L and 0.67 g/L with their corresponding lipid yield 0.19 g/L and 0.22 g/L. When the concentration of CO2was 6%, Chlorella vulgaris grew the fastest and its biomass dry weight was 2.42 g/L with the highest lipid yield of 0.72 g/L. When the concentration of CO2was too low, the supply of inorganic carbon was insufficient and lipid yield was low. A too high concentration of CO2caused a low pH and lipid accumulation was inhibited. Na2CO3and NaHCO3were more favorable for Chlorella vulgaris to accumulate unsaturated fatty acids than that of CO2.

Keywords:Chlorella vulgaris, autotrophy, inorganic carbon, biodiesel

目前人類使用的能源主要是化石能源，而化石能源存在不可再生、其使用后造成環(huán)境污染、危害人類健康、CO2排放等嚴(yán)重的問題，開發(fā)化石能源的替代能源已經(jīng)成為科技工作者的當(dāng)務(wù)之急[1-2]。生物柴油以其可再生、環(huán)境友好、安全的特性，被視為本世紀(jì)最具發(fā)展?jié)摿Φ男履茉粗弧Ｉ锊裼偷脑嫌泻芏?，但是相比之下，微藻油脂作為生物柴油原料有其?dú)特的優(yōu)勢(shì)，因微藻光合作用效率高、生長(zhǎng)周期短、單位面積產(chǎn)量大、易于培養(yǎng)、油脂含量高、減排 CO2，而且能將產(chǎn)油脂與太陽能利用、廢水凈化相結(jié)合；微藻生物柴油已成為國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的研究熱點(diǎn)[3]。

小球藻是一種富含油脂的微藻[4]，其油脂是以CO2為光合作用反應(yīng)物經(jīng)一系列代謝而合成。研究報(bào)道表明[5]，小球藻還能利用細(xì)胞表面的碳酸酐酶將轉(zhuǎn)化成CO2供RUBPase固定，因此小球藻只能固定水中 CO2和兩種形式的溶解無機(jī)碳。目前，小球藻生物柴油研究過程中采用的碳源一般為無機(jī)碳源，所用無機(jī)碳源多為 CO2，研究多集中于 CO2濃度優(yōu)化[6]、通 CO2速率對(duì)小球藻產(chǎn)油的影響[7]，在小球藻利用 CO2產(chǎn)油研究方面已取得了較大進(jìn)展。和形式的無機(jī)碳源對(duì)小球藻產(chǎn)油的影響未見報(bào)道。海水中存在 Ca2+、Mg2+等離子，會(huì)對(duì)Na2CO3、NaHCO3和CO2三種無機(jī)碳源在培養(yǎng)液中所形成的溶解無機(jī)碳形式及其比例產(chǎn)生影響。培養(yǎng)液中溶解無機(jī)碳形式及其比例影響小球藻對(duì)其中和 CO2的利用，因而 Na2CO3、NaHCO3和 CO2三種無機(jī)碳源會(huì)影響小球藻生長(zhǎng)及其油脂合成代謝。而目前尚未見有關(guān)不同無機(jī)碳源(Na2CO3、NaHCO3和 CO2) 及其初始濃度對(duì)海洋小球藻光合作用及其油脂合成代謝、脂肪酸分布影響的報(bào)道。

本文以海洋小球藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究 3種無機(jī)碳源 (Na2CO3、NaHCO3和CO2) 及其各初始濃度下小球藻的產(chǎn)油特性，并分析脂肪酸組成的差異，旨在提高小球藻對(duì)無機(jī)碳源的利用效率及其產(chǎn)油效率，為自養(yǎng)小球藻工業(yè)化高產(chǎn)油脂和減排 CO2提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，推動(dòng)微藻生物柴油的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藻種：試驗(yàn)所用的小球藻 Chlorella vulgaris LICME001 (中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心編號(hào)：CCTCC No: M 209256) 由南京工業(yè)大學(xué)工業(yè)催化與代謝工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

保種培養(yǎng)基：采用f/2液體培養(yǎng)基。

試驗(yàn)培養(yǎng)基 (g/L)：海鹽 34，Na2EDTA 0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，KH2PO40.1 和 KNO30.3。分別加入初始濃度為 0、20、40、60和 80 mmol/L的Na2CO3或NaHCO3，或通入濃度為0、3%、6%、9%和 12%的 CO2(供氣采用高純 CO2鋼瓶與高純N2鋼瓶，CO2和N2氣體混合用氣體混合器來實(shí)現(xiàn)，通氣量為 0.3 vvm)，以研究不同無機(jī)碳源下小球藻產(chǎn)油特性。以0.5 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值。

1.2 試驗(yàn)方法

搖瓶培養(yǎng)：根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，將對(duì)數(shù)期藻種細(xì)胞接種到250 mL三角瓶，接種量 (V/V) 為10%，在恒溫光照搖床中培養(yǎng)，條件為150 r/min，25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx。

光生物反應(yīng)器培養(yǎng)：將搖瓶中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的藻種接種到反應(yīng)器中，反應(yīng)器為本實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計(jì)的鼓泡式光生物反應(yīng)器，反應(yīng)器規(guī)格：體積為2 L (工作體積為1.5 L)；外置光源 (日光燈)，接種量 (V/V)為10%，整個(gè)培養(yǎng)過程光照強(qiáng)度為5 000 lx，光暗周期=12∶12，溫度為 (25±2) ℃，培養(yǎng)周期為 10 d。

1.3 分析檢測(cè)方法

葉綠素含量的測(cè)定：取5 mL藻液，低速離心收集藻細(xì)胞，用雙蒸水洗3 次，加入5 mL的100%甲醇溶液，用移液器吹吸均勻，室溫避光靜置1 h后，8 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清，測(cè)定OD652及OD665值。根據(jù)下列公式分別計(jì)算出葉綠素a和b含量 (單位：mg/L)[8]：

pH值測(cè)定：取30 mL藻液于離心管中，用pH計(jì) (雷磁 pHS-3D，上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定。

生物量的測(cè)定：用UV-1200型紫外可見分光光度計(jì) (上海美譜達(dá)儀器有限公司) 在680 nm處測(cè)定藻液光密度 (OD)，每天測(cè)定1次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 C (生物量干重)=0.560×OD680(R2=0.986) 換算成藻生物質(zhì)干重。

產(chǎn)油量測(cè)定：待測(cè)定藻液經(jīng)離心收集藻體后，藻體用蒸餾水洗滌3 次，經(jīng)溶菌酶破碎 (破碎條件：50 ℃，10 h，酶用量：50 mg/L)，提取油脂，油脂提取采用Bligh和Dyer法[9]，油脂重量測(cè)定采用稱重法[10]。試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

油脂組成 GC-MS檢測(cè)：分別取經(jīng) Na2CO3(濃度：40 mmol/L)、NaHCO3(濃度：40 mmol/L) 和 CO2(濃度：6%) 培養(yǎng)10 d的藻粉0.5 g，經(jīng)提取油脂，采用 KOH-CH3OH甲酯化[11]，脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜定性定量分析參考文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

2.1.1 三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻光合色素的影響

葉綠素是小球藻的光合色素，其含量的高低直接影響光合作用效率[13]。圖 1為不同初始濃度Na2CO3、NaHCO3和CO2對(duì)小球藻葉綠素 a和 b含量的影響。由圖1可見，經(jīng)過10 d培養(yǎng)，當(dāng)Na2CO3初始濃度從0 mmol/L增加到80 mmol/L時(shí)，葉綠素a含量從1.18 mg/L增加到6.16 mg/L，葉綠素b含量從0.15 mg/L增加到1.96 mg/L；當(dāng)Na2CO3初始濃度為40 mmol/L時(shí)，其葉綠素a含量為6.16 mg/L和葉綠素b含量為1.96 mg/L，均達(dá)到各自的最高。培養(yǎng)10 d后，當(dāng)NaHCO3初始濃度從0 mmol/L增加到80 mmol/L時(shí)，葉綠素a含量從1.14 mg/L增加到8.71 mg/L，葉綠素b含量從0.28 mg/L增加到3.08 mg/L；當(dāng)NaHCO3初始濃度為40 mmol/L時(shí)，其葉綠素a和b含量均達(dá)到各自的最大值，分別為8.71和3.08 mg/L。隨著CO2濃度的增加，其對(duì)應(yīng)的葉綠素a和b含量均分別呈先增加后下降的趨勢(shì)；當(dāng)CO2濃度為6%時(shí)，其葉綠素a含量為18.14 mg/L，葉綠素b含量為6.02 mg/L，均達(dá)到各自的最大值。三種無機(jī)碳源培養(yǎng)后，葉綠素 a與 b的比例為2∶1~4∶1。

三種無機(jī)碳源中，直接通 CO2時(shí)葉綠素含量最高，說明最有利于小球藻光合作用；實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)：添加Na2CO3和NaHCO3時(shí)，培養(yǎng)液變渾濁，這可能與培養(yǎng)液添加了海鹽，所使用的海鹽中含有Mg2+、Ca2+等離子有關(guān)；試驗(yàn)中添加的Na2CO3和NaHCO3與海鹽中的Mg2+、Ca2+等離子形成了MgCO3、CaCO3等沉淀，從而影響了小球藻光合作用過程中無機(jī)碳的供給和光合色素合成。而通入 CO2培養(yǎng)液沒有變渾濁，說明沒有形成沉淀，因此小球藻無機(jī)碳源的供給不受影響，其光合色素合成不受影響，光合作用效率高。在藻培養(yǎng)過程中 NaHCO3有兩個(gè)作用：一是作為無機(jī)碳源，二是調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值，保持堿性環(huán)境，可抑制污染生物繁殖，保證藻養(yǎng)殖質(zhì)量。Yoo等的研究也表明無機(jī)碳源的供給影響小球藻的生長(zhǎng)[6]。

2.1.2 三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻培養(yǎng)結(jié)束時(shí)pH值的影響

將培養(yǎng)液的初始pH調(diào)至7.2，接種海洋小球藻藻種，培養(yǎng)10 d后，測(cè)定其培養(yǎng)液pH，各小球藻培養(yǎng)液的pH值見圖2。經(jīng)過10 d培養(yǎng)，當(dāng)Na2CO3初始濃度從0 mmol/L增加到80 mmol/L時(shí)，pH值從7.6上升到9.2；當(dāng)Na2CO3初始濃度為40 mmol/L時(shí)，其pH值達(dá)到最高為9.2。培養(yǎng)10 d后，當(dāng)NaHCO3初始濃度從0 mmol/L增加到80 mmol/L時(shí)，pH值從7.7上升到9.8；當(dāng)NaHCO3初始濃度為40 mmol/L時(shí)，其pH值達(dá)到最高為9.8。隨著CO2濃度的增加，其對(duì)應(yīng)的 pH值呈先增加后下降的趨勢(shì)；當(dāng) CO2濃度為6%時(shí)，其pH值達(dá)到最大為9.5。較初始pH值，小球藻經(jīng)不同初始濃度Na2CO3、NaHCO3和CO2培養(yǎng)10 d后，其培養(yǎng)液pH值均上升，即出現(xiàn)pH漂移現(xiàn)象，但漂移程度不同。研究結(jié)果表明，在不同初始濃度Na2CO3、NaHCO3和CO2培養(yǎng)下，小球藻生長(zhǎng)越快，其 pH漂移越明顯 (圖2、3)。隨著 pH的升高，小球藻生長(zhǎng)變緩，說明改變后的pH可能已經(jīng)偏離該藻的最佳生長(zhǎng)范圍。

圖1 三種無機(jī)碳源對(duì)葉綠素含量的影響Fig. 1 Effect of three kinds of inorganic carbon source on chlorophyll content of Chlorella vulgaris.

圖2 三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻培養(yǎng)液pH的影響Fig. 2 Effect of three kinds of inorganic carbon source on the pH of Chlorella vulgaris culture medium.

圖3 三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻生物量的影響Fig. 3 Effect of three kinds of inorganic carbon source on biomass of Chlorella vulgaris.

本研究結(jié)果表明三種無機(jī)碳源培養(yǎng)小球藻，出現(xiàn)pH漂移現(xiàn)象。這是由于小球藻在密閉光生物反應(yīng)器中一定pH值的添加海鹽培養(yǎng)液及適宜溫度、光照等條件下連續(xù)照光，隨小球藻光合作用對(duì)無機(jī)碳的利用，水中無機(jī)碳不斷減少，導(dǎo)致pH值不斷升高，故出現(xiàn)pH漂移的現(xiàn)象[14]。pH影響培養(yǎng)液中HCO3?、CO2和的存在形式和比例，為消除培養(yǎng)液初始pH值差異的影響，本實(shí)驗(yàn)3種無機(jī)碳培養(yǎng)液初始pH均調(diào)為7.2，此時(shí)培養(yǎng)液中HCO3?、CO2和存在形式和比例是一樣的[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (圖3) 表明通 CO2最有利于小球藻對(duì)溶解無機(jī)碳的利用，NaHCO3次之，Na2CO3利用效果最差。這是由于在配培養(yǎng)液時(shí) (調(diào)初始pH前)，NaHCO3和Na2CO3與培養(yǎng)液所添加海鹽中的 Mg2+、Ca2+等形成了沉淀，添加Na2CO3所形成的沉淀比NaHCO3多 (根據(jù)培養(yǎng)液的渾濁程度判斷)，而通CO2沒有形成沉淀；故添加 NaHCO3、添加 Na2CO3和通 CO2培養(yǎng)液中所含HCO3?、CO2和的摩爾數(shù)不一樣，通 CO2培養(yǎng)液所含、CO2和的摩爾數(shù)＞添加NaHCO3培養(yǎng)液＞添加 Na2CO3培養(yǎng)液。培養(yǎng)液 pH影響溶解無機(jī)碳形式及其比例，當(dāng)海水pH值小于6時(shí)，溶解無機(jī)碳以和CO2兩種形式存在，其中以CO2形式為主；當(dāng)海水pH值介于6和9之間時(shí)，溶解無機(jī)碳以、CO2和CO32?三種形式存在，其中以形式為主；當(dāng)海水 pH值大于 9時(shí)，溶解無機(jī)碳以和CO32?兩種形式存在，其中以形式為主[15]。而小球藻只能固定 CO2和兩種形式的溶解無機(jī)碳[5]，本實(shí)驗(yàn)pH漂移影響小球藻對(duì)溶解無機(jī)碳的利用，故pH漂移影響小球藻的生長(zhǎng)和產(chǎn)油。因此，對(duì)小球藻利用無機(jī)碳源產(chǎn)油的后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步調(diào)控培養(yǎng)液pH，以期得到更理想的單位產(chǎn)油量。

2.1.3 三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻生物量的影響

圖3為不同初始濃度Na2CO3、NaHCO3和CO2對(duì)小球藻生物量的影響。從圖 3中可以看出，當(dāng)Na2CO3初始濃度為0~80 mmol/L時(shí)，各初始濃度對(duì)小球藻生物量的影響趨勢(shì)相近，接種后 2 d內(nèi)，各濃度的生物量沒有差異；2 d后，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，各濃度的生物量均呈先增加后達(dá)到穩(wěn)定，生物量在培養(yǎng) 7 d左右達(dá)到穩(wěn)定，各濃度的最大生物量介于 0.16~0.52 g/L之間。當(dāng) NaHCO3初始濃度為0~80 mmol/L時(shí)，各初始濃度下小球藻生物量增長(zhǎng)趨勢(shì)相近，接種后 2 d內(nèi)，各濃度的生物量沒有差異；2 d后，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，各濃度的生物量均呈先增加后達(dá)到穩(wěn)定，生物量在培養(yǎng) 7 d左右達(dá)到穩(wěn)定，各濃度的最大生物量介于0.16~0.67 g/L之間。當(dāng)CO2初始濃度為0~12%時(shí)，各初始濃度下小球藻生物量增長(zhǎng)趨勢(shì)相近，接種后2 d內(nèi)，各濃度的生物量沒有差異；2 d后，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，各濃度的生物量均呈先增加后達(dá)到穩(wěn)定，生物量在培養(yǎng) 9 d左右達(dá)到穩(wěn)定，各濃度的最大生物量介于0.16~2.42 g/L之間。當(dāng)Na2CO3、NaHCO3和CO2初始濃度分別為40 mmol/L、40 mmol/L和6%時(shí)，其生物量 (分別為：0.52、0.67和2.42 g/L) 均達(dá)到各自的最大值，分別是未添加無機(jī)碳的3.3、4.2和15.1倍；Na2CO3、NaHCO3和 CO2初始濃度過高或過低生物量均減少。

直接通 CO2生物量最高，說明最有利于小球藻生長(zhǎng)；而Na2CO3作為無機(jī)碳源時(shí)生物量最低，說明最不利于小球藻生長(zhǎng)。這可能與Na2CO3和NaHCO3作為碳源會(huì)與海鹽中 Mg2+、Ca2+等相關(guān)離子產(chǎn)生沉淀有關(guān)。在配培養(yǎng)液時(shí)，NaHCO3和Na2CO3與培養(yǎng)液所添加海鹽中的 Mg2+、Ca2+等形成了沉淀，添加Na2CO3所形成的沉淀比 NaHCO3多 (根據(jù)培養(yǎng)液的渾濁程度判斷)，從而添加 Na2CO3比添加 NaHCO3對(duì)小球藻利用無機(jī)碳源的影響更大；而通 CO2沒有形成沉淀，不影響小球藻對(duì)無機(jī)碳源的利用。本試驗(yàn)研究表明適宜濃度的無機(jī)碳源有利于小球藻的生長(zhǎng)；這與劉然等的研究結(jié)果一致[16]。

2.2 三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻油脂的影響

2.2.1 三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻油脂產(chǎn)量的影響

圖4 三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻油脂產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of three kinds of inorganic carbon source on lipid yield of Chlorella vulgaris.

不同初始濃度Na2CO3、NaHCO3和CO2對(duì)小球藻油脂產(chǎn)量的影響見圖4。由圖4可知，接種后前2天，各濃度油脂產(chǎn)量均不增加，此后隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，對(duì)應(yīng)的油脂產(chǎn)量均分別呈先快速增加后穩(wěn)定增加；當(dāng)Na2CO3、NaHCO3和CO2初始濃度分別為40 mmol/L、40 mmol/L和6%時(shí)，其對(duì)應(yīng)油脂產(chǎn)量(分別為：0.19、0.22和0.72 g/L) 均達(dá)到各自的最大值；通CO2的最大油脂產(chǎn)量是添加Na2CO3、NaHCO3和未添加無機(jī)碳的 3.8、3.3和 12倍；Na2CO3、NaHCO3和 CO2初始濃度過高或過低均不利于油脂的合成。添加無機(jī)碳源較未添加的油脂產(chǎn)量高。

在三種無機(jī)碳源中，直接通CO2油脂產(chǎn)量最高，說明最有利于小球藻油脂積累；而Na2CO3作為無機(jī)碳源時(shí)油脂產(chǎn)量最低，說明最不利于小球藻油脂積累。在通入CO2過程中會(huì)形成對(duì)培養(yǎng)液的攪拌作用，攪拌作用一方面有利于藻細(xì)胞與培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等之間的充分接觸，同時(shí)可避免藻細(xì)胞在培養(yǎng)過程中下沉。另一方面有利于藻在反應(yīng)器中暗、光照區(qū)的交換，提高其光合效率，因此促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)和油脂積累[17]。低或高濃度CO2均不利于油脂積累，這可能是由于 CO2是光合作用和油脂合成的底物，CO2濃度低則光合作用和油脂合成的底物供應(yīng)不足。而CO2濃度過高則會(huì)引起培養(yǎng)液的pH過低[7]。pH下降勢(shì)必影響小球藻油脂合成過程中核酮糖1,5-二磷酸羧化酶、乙酰輔酶A羧化酶等關(guān)鍵酶活性。本研究還發(fā)現(xiàn)：通過馴化，可以顯著提高小球藻對(duì)CO2濃度的耐受能力；經(jīng)過 5個(gè)馴化周期，小球藻耐CO2濃度可達(dá)10%以上，這有待進(jìn)一步研究。

2.2.2 三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻脂肪酸組成的影響

為考察三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻脂肪酸組成的影響，利用 GC-MS檢測(cè)了最佳初始濃度 Na2CO3(40 mmol/L)、NaHCO3(40 mmol/L) 和 CO2(6%)對(duì)應(yīng)小球藻主要脂肪酸的組成。由表1可得，培養(yǎng)10 d后，三種無機(jī)碳源 (Na2CO3、NaHCO3和CO2)培養(yǎng)的小球藻所含主要脂肪酸種類相同，且其碳鏈長(zhǎng)度均介于C14到C20之間，其中95%以上脂肪酸是C16和C18系列脂肪酸；三種無機(jī)碳源培養(yǎng)的小球藻不飽和脂肪酸含量均在 70%以上，而添加Na2CO3和NaHCO3其不飽和脂肪酸比例較通入CO2高。這可能與不利條件下生長(zhǎng)的微藻其不飽和脂肪酸含量會(huì)增加有關(guān)[18]。研究表明生物柴油含有的脂肪酸主要是棕櫚酸 (C16∶0)、十六碳烯酸 (16∶1)、硬 脂 酸 (C18∶0)、 油 酸 (C18∶1) 和 亞 麻 酸(C18∶3)[19]，而以上 5種脂肪酸在本實(shí)驗(yàn)小球藻脂肪酸中所占比例在90%以上，因此小球藻油脂是良好的生物柴油原料。

表1 三種無機(jī)碳源對(duì)小球藻脂肪酸組成 (占總脂肪酸含量的百分比) 的影響Table 1 Effect of three kinds of inorganic carbon source on fatty acids composition of Chlorella vulgaris (percent of total fatty acids)

3 結(jié)論

三種無機(jī)碳源及其初始濃度對(duì)小球藻生長(zhǎng)及產(chǎn)油均具有顯著影響。Na2CO3、NaHCO3和 CO2均可作為小球藻自養(yǎng)產(chǎn)油脂的碳源，Na2CO3、NaHCO3和CO2最佳初始濃度分別為40 mmol/L、40 mmol/L和 6%，Na2CO3、NaHCO3和 CO2初始濃度過高或過低均不利于小球藻生長(zhǎng)及產(chǎn)油。由于本實(shí)驗(yàn)小球藻是海洋小球藻，所用海鹽中存在 Ca2+、Mg2+等離子，Na2CO3和NaHCO3作為無機(jī)碳源的效果較差。CO2是最佳無機(jī)碳源；CO2作為無機(jī)碳源不會(huì)與海鹽中的 Ca2+、Mg2+等離子形成沉淀，而向藻液中通入 CO2所形成的攪拌有利于小球藻受光、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和防止小球藻細(xì)胞下沉。小球藻只能固定水中CO2和HCO3?兩種形式的溶解無機(jī)碳，但Na2CO3也可作為小球藻自養(yǎng)產(chǎn)油脂的碳源，說明其在水中溶解后可能含有 CO2和HCO3?兩種形式或其中某一種形式。小球藻葉綠素a與b的比例為2∶1~4∶1。小球藻經(jīng)三種無機(jī)碳源培養(yǎng)后，其培養(yǎng)液 pH值上升。三種無機(jī)碳源 (Na2CO3、NaHCO3和CO2) 培養(yǎng)的小球藻所含主要脂肪酸種類相同，添加 Na2CO3和NaHCO3其不飽和脂肪酸比例較通入CO2高；三種無機(jī)碳源的脂肪酸95%以上是C16和C18系列脂肪酸，其不飽和脂肪酸含量均在70%以上，因此小球藻油脂是制備生物柴油的良好原料。

致謝：感謝中國(guó)石油天然氣股份有限公司資助！

REFERENCES

[1] Sun T, Du W, Liu DH, et al. Stability of whole cell biocatalyst for biodiesel production from renewable oils.Chin J Biotech, 2009, 25(9): 1379?1385.孫婷, 杜偉, 劉德華, 等. 固定化全細(xì)胞催化可再生油脂合成生物柴油的穩(wěn)定性. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(9):1379?1385.

[2] Zheng HL, Zhang Q, Ma XC, et al. Research progress on bio-diesel producing microalgae cultivation. China Biotechnol, 2009, 29(3): 110?116.鄭洪立, 張齊, 馬小琛, 等. 產(chǎn)生物柴油微藻培養(yǎng)研究進(jìn)展. 中國(guó)生物工程雜志, 2009, 29(3): 110?116.

[3] Chisti Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol Adv,2007, 25(3): 294?306.

[4] Schenk PM, Thomas-Hall SR, Stephens E, et al. Second generation biofuels: high-efficiency microalgae for biodiesel production. Bioenerg Res, 2008, 1(1): 20?43.

[5] Cheng LH, Zhang L, Chen HL, et al. Advances on CO2fixation by microalgae. Chin J Biotech, 2005, 21(2):177?181.程麗華, 張林, 陳歡林, 等. 微藻固定 CO2研究進(jìn)展.生物工程學(xué)報(bào), 2005, 21(2): 177?181.

[6] Yoo C, Jun SY, Lee JY, et al. Selection of microalgae for lipid production under high levels carbon dioxide.Bioresource Technol, 2010, 101(1): S71?S74.

[7] Chiu SY, Kao CY, Tsai MT, et al. Lipid accumulation andCO2utilization of Nannochloropsis oculata in response to CO2aeration. Bioresource Technol, 2009, 100(2): 833?838.

[8] Porra RJ, Thompson WA, Kriedemann PE. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.Biochimica et Biophysica Acta, 1989, 975(3): 384?394.

[9] Elince GB, William MD. A rapid method of lipid extraction and purification. Can J Biochem and Physiol,1959, 37: 911?917.

[10] Converti A, Casazza AA, Ortiz EY, et al. Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production. Chem Eng Proc, 2009,48(6): 1146?1151.

[11] Volkman JK, Jeffrey SW, Nichols PD, et al. Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture. J Exp Mar Biol Ecol, l989, 128(3): 2l9?240.

[12] Jin MJ, Huang H, Xiao AH, et al. A novel two-step fermentation process for improved arachidonic acid production by Mortierella alpina. Biotechnol Lett, 2008,30(6): 1087?1091.

[13] Liu ZY, Wang GC. Dynamics of lipid accumulation in marine microalga Chlorella vulgaris promoted by iron.Mar Sci, 2008, 32(11): 56?59.

劉志媛, 王廣策. 鐵促進(jìn)海水小球藻油脂積累的動(dòng)態(tài)過程. 海洋科學(xué), 2008, 32(11): 56?59.

[14] Yue GF, Wang JX, Zhu MY, et al. Progress of inorganic carbon acquisition by algae (I): origin and methods of the studies. Mar Sci, 2003, 27(5): 15?18.

岳國(guó)峰, 王金霞, 朱明遠(yuǎn), 等. 藻類無機(jī)碳營(yíng)養(yǎng)的研究進(jìn)展(I)——研究起源及研究方法. 海洋科學(xué), 2003,27(5): 15?18.

[15] Beer S, Eshel A, Waisel Y. Carbon metabolism of seagrasses(I). The utilization of exogenous inorganic carbon species in photosynthesis. J Exp Bot, 1977, 28(5): 1180?1187.

[16] Liu R, Liu XJ, Wang M, et al. Effects of inorganic carbon sources on growth of Pinguiococcus pyrenoidosus CCMP 2078. Ecol Sci, 2007, 26(3): 227?231.

劉然, 劉曉娟, 王銘, 等. 不同無機(jī)碳源對(duì)粉核油球藻生長(zhǎng)的影響. 生態(tài)科學(xué), 2007, 26(3): 227?231.

[17] Michels MHA, van der Goot AJ, Norsker NH, et al.Effects of shear stress on the microalgae Chaetoceros muelleri. Bioproc Biosyst Eng, 2010, 33(8): 921?927.

[18] Renaud SM, Thinh LV, Lambrinidis G, et al. Effect of temperature on growth, chemical composition and fatty acid composition of tropical Australian microalgae grown in batch cultures. Aquaculture, 2002, 211(1/4): 195?214.

[19] Knothe G. ‘‘Designer” biodiesel: optimizing fatty ester composition to improve fuel properties. Energ Fuel, 2008,22(2): 1358?1364.

Effect of inorganic carbon source on lipid production with autotrophic Chlorella vulgaris

Hongli Zheng1, Zhen Gao2, Qi Zhang1, He Huang1,3, Xiaojun Ji1, Honglei Sun4, and Chang Dou1
1 College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China
2 College of Food Science and Light Industry, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China
3 State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, Nanjing 210009, China
4 Petroleum Research Institute, China National Petroleum Corporation, Beijing 100029, China

Received: September 6, 2010; Accepted: February 21, 2011

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 20936002), National Basic Rsearch Program of China (973 Program) (Nos.2007CB707805, 2009CB724700, 2011CB200906), the Fifth of Six Projects Sponsoring Talent Summits of Jiangsu Province, College Industrialization Project of Jiangsu Province, Program for Century Excellent Talents in University from the Ministry of Education of China (No. NCET-09-0157), Fok Ying Tung Education Foundation, Ministry of Education of China (No. 123014).

Corresponding author: Zhen Gao. Tel/Fax: +86-25-83172094; E-mail: gaozhen@njut.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 20936002)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (Nos. 2007CB707805, 2009CB724700, 2011CB200906)，江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目，江蘇省高校科研成果產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)項(xiàng)目，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃 (No. NCET-09-0157)，教育部霍英東教育基金資助(No. 123014) 資助。