陳小睿，田會(huì)萍，李佳川，孟憲麗

點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 610075

腦缺血卒中是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見危急重癥。以川芎為代表的活血化瘀中藥對(duì)腦缺血卒中具有獨(dú)到療效?，F(xiàn)代研究認(rèn)為川芎嗪、阿魏酸等為川芎治療心腦血管疾病的主要成分，而針對(duì)川芎揮發(fā)油應(yīng)用于腦血管病治療的研究報(bào)道較少。通脈醒腦滴丸是以川芎揮發(fā)油為主要組方原料的中藥制劑。本文通過觀察通脈醒腦滴丸對(duì)缺血再灌注大鼠模型的腦保護(hù)作用，初步探討其可能的作用機(jī)制，以期為尋找川芎防治腦缺血新的作用部位提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

通脈醒腦滴丸(10 mg/粒，成都潤華藥業(yè)有限公司，批號(hào):070530);尼莫地平片(20 mg/片，山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào):070109)

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

SOD試劑盒、MDA試劑盒、NO試劑盒、GSH－Px試劑盒和考馬斯亮蘭試劑盒(南京建成生物工程研究所)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

722S型分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)、BP221S型電子天平(SARTORIUS)、DHW－600型不銹鋼電熱恒溫水箱(北京國華醫(yī)療器械廠)、醫(yī)用超低溫冰箱(日本SANYO)、LD2－5醫(yī)用離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)等。

1.4 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，體重300±20 g，雌雄各半，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供(合格證號(hào):SCXK(川)2004－15)

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 動(dòng)物分組和給藥劑量及方法

健康SD大鼠210只，雌雄各半，隨機(jī)將每批大鼠分為7組:第1組為假手術(shù)組;第2組為模型組;第3、4、5、6組分別為通脈醒腦滴丸大鼠1組、2組、3組和4組;第7組為陽性對(duì)照尼莫地平組。每組30只，分3批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第一批用于測(cè)定腦組織含水率，第二批用于觀察行為學(xué)表現(xiàn)和測(cè)定腦組織梗死率，第三批用于腦組織勻漿的生化檢查，每批每組各10只。

通脈醒腦滴丸各組灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7日。假手術(shù)組及模型組給予等容積蒸餾水。第7天給藥1 h后，假手術(shù)組大鼠僅在麻醉狀態(tài)下分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，不予阻斷血流。陽性組、模型組和各給藥組按照下述2.2所示方法建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注模型。再灌注第23 h后給藥一次，第24 h頸椎脫位處死動(dòng)物取腦。

2.2 大鼠線栓法致局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)的制備

參照文獻(xiàn)報(bào)道［1～3］，第7天給藥1 h后，線栓阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)，2 h后拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。以動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)提尾時(shí)左前肢屈曲或前進(jìn)時(shí)左側(cè)劃圈征為右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞成功標(biāo)志。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 13.0 For Windows軟件提供的非參數(shù)檢驗(yàn)(Nonparametric Tests)和方差分析(ONE－WAY ANOVA)進(jìn)行處理。

2.4 大鼠行為學(xué)評(píng)分的測(cè)定

大鼠處死之前，根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第三版記載的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［4］，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，分?jǐn)?shù)越高，動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 通脈醒腦滴丸對(duì)線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)的影響()

表1 通脈醒腦滴丸對(duì)線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)的影響()

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分假手術(shù)組 等容積蒸餾水 10組別 劑量(mg·kg－1) 動(dòng)物數(shù)(只)—模型組 等容積蒸餾水 10 7.5±1.6通脈醒腦滴丸大鼠1組 147.70 10 5.1±1.9*通脈醒腦滴丸大鼠2組 73.85 10 5.2±1.9*通脈醒腦滴丸大鼠3組 36.93 10 6.2±2.5通脈醒腦滴丸大鼠4組 18.46 10 6.7±2.2尼莫地平組 10.00 10 4.6±1.9＊＊

由表1可見，通脈醒腦滴丸大鼠1組、2組神經(jīng)功能缺損有所改善(P＜0.01～0.05)。通脈醒腦滴丸大鼠3組和4組較之模型組，神經(jīng)功能缺損有改善的趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 腦組織含水率的測(cè)定

大鼠頸椎脫位處死。取腦，沖洗并吸干表面水分，電子天平精確稱量濕重，入烘箱105℃烘干48 h后取出，經(jīng)反復(fù)稱量直至恒重后(每天稱一次，直至兩次重量變化小于1%)，記錄作為組織干重。用干濕重法求得含水率，公式如下:

腦組織含水率(%)=(濕重－干重)/濕重×100%實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

從表2可見，通脈醒腦滴丸大鼠1組、大鼠2組、大鼠3組三個(gè)劑量組的腦水腫程度有所降低(P＜0.01～0.05)。

2.6 腦梗死比率的測(cè)定

大鼠頸椎脫位處死。取腦，冠狀面均勻切成約2 mm的厚腦片，放入1%TTC磷酸緩沖溶液中，水浴鍋避光37℃溫孵30 min后，取出置于10%甲醛中避光固定24 h，濾紙吸干表面液體，電子天平精密稱取總重并記錄。眼科鑷精確剝離梗死部位，精密稱量并記錄。腦梗死比率測(cè)定采用公式:

腦梗死比率(%)=(梗死部分重量/全腦重量)×100%

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 通脈醒腦滴丸對(duì)線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織含水率的影響()

表2 通脈醒腦滴丸對(duì)線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織含水率的影響()

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量(mg·kg－1) 動(dòng)物數(shù)(只) 腦組織含水率(%)假手術(shù)組 等容積蒸餾水 10 78.64±1.72＊＊模型組 等容積蒸餾水 10 81.87±0.70通脈醒腦滴丸大鼠1組 147.70 10 79.97±0.94＊＊通脈醒腦滴丸大鼠2組 73.85 10 80.67±0.74*通脈醒腦滴丸大鼠3組 36.93 10 80.81±0.56*通脈醒腦滴丸大鼠4組 18.46 10 80.89±1.64尼莫地平組 10.00 10 79.83±0.76＊＊

表3 對(duì)線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死比率的影響()

表3 對(duì)線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死比率的影響()

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量(mg·kg－1) 動(dòng)物數(shù)(只) 腦梗死比率(%)假手術(shù)組 等容積蒸餾水 10—模型組 等容積蒸餾水 10 12.67±1.28通脈醒腦滴丸大鼠1組 147.70 10 8.96±1.36＊＊通脈醒腦滴丸大鼠2組 73.85 10 10.13±1.86＊＊通脈醒腦滴丸大鼠3組 36.93 10 11.16±1.5*通脈醒腦滴丸大鼠4組 18.46 10 11.24±1.42*尼莫地平組 10.00 10 7.56±1.12＊＊

從表3可見，通脈醒腦滴丸各組均能降低大鼠腦梗死比率(P＜0.01～0.05)。

2.7 對(duì)線栓法致大鼠腦缺血再灌注模型自由基氧化損傷的影響

各組大鼠再灌注23 h后，給藥一次。給藥1 h后，即再灌注24 h，股動(dòng)脈放血處死大鼠。取腦后于冰盤上去除嗅球、小腦及腦干，用生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙吸干，立即稱濕重。按1:9(W/V)加入生理鹽水，冰水浴研制10%腦組織勻漿液，4000轉(zhuǎn)/分冷凍離心10 min，取上清液超低溫冰箱保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，采用722分光光度計(jì)，黃嘌呤氧化酶法550 nm處測(cè)定SOD活力、硫代巴比妥酸法532 nm處測(cè)定MDA含量、硝酸還原酶法550 nm處測(cè)定NO含量、化學(xué)發(fā)光法412 nm處測(cè)定GSH－Px活力、考馬斯亮蘭法595 nm處測(cè)定組織勻漿上清液蛋白含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4可見，通脈醒腦滴丸大鼠1組能明顯增加SOD和GSH－Px的活性(P＜0.01～0.05)，降低 MDA和NO的含量(P＜0.01～0.05);通脈醒腦滴丸大鼠2組能提高SOD活力，降低MDA的含量(P＜0.05);通脈醒腦滴丸大鼠3組可降低MDA和NO的含量(P＜0.05)。

表4 通脈醒腦滴丸對(duì)線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織SOD活性、MDA、NO含量、GSH－Px活力的影響(，n=10)

表4 通脈醒腦滴丸對(duì)線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織SOD活性、MDA、NO含量、GSH－Px活力的影響(，n=10)

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量(mg·kg－1) SOD(U·mgprot－1) MDA(nmol·mgprot－1) NO(μmol· gprot－1) GSH－Px(活力單位)假手術(shù)組 等容積蒸餾水 108.19±18.40＊＊ 3.16±1.02＊＊ 3.51±0.75＊＊ 106.40±12.14＊＊模型組 等容積蒸餾水 68.03±17.96 4.99±1.33 5.59±1.18 78.79±13.42通脈醒腦滴丸1組 147.70 95.70±18.19＊＊ 3.63±1.11＊＊ 4.42±1.13* 90.71±12.14*通脈醒腦滴丸2 組 73.85 86.37±8.80* 3.97±0.99* 4.81±1.13 87.48±7.46通脈醒腦滴丸3 組 36.93 80.86±11.90 4.01±0.47* 4.60±1.06* 85.29±6.54通脈醒腦滴丸4 組 18.46 81.85±20.40 4.61±1.10 4.73±0.99 86.86±11.31尼莫地平組 10.00 90.26±17.07＊＊ 3.35±0.66＊＊ 4.42±0.60* 91.52±10.86＊＊

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)含有豐富的不飽和脂肪酸，較易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。腦缺血時(shí)，自由基生成過多，引發(fā)強(qiáng)烈的鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。當(dāng)再灌注組織重新獲得氧的供應(yīng)，更易誘發(fā)“氧爆發(fā)”，加重組織損害。

生理?xiàng)l件下人體細(xì)胞內(nèi)存在的自由基清除劑包括超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)等，反映了機(jī)體清除自由基的能力。丙二醛(MDA)為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，?？梢苑从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。

NO具有神經(jīng)毒性，是谷氨酸興奮毒性的主要介質(zhì)，還可通過過氧化亞硝基陰離子(ONOO—)使線粒體內(nèi)錳超氧化物歧化酶(Mn－SOD)失活，或再分解為具有更強(qiáng)神經(jīng)毒性的羥基及二氧化氮(NO2—)自由基［5］，加重缺血再灌注損傷［6］。

研究認(rèn)為［7］，大量自由基可以使血清內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物含量明顯增加，導(dǎo)致血粘度升高，血小板聚集性增強(qiáng)，易于形成血栓，造成脈道失利，血行障礙。許多活血化瘀中藥如川芎、丹參、三七等被認(rèn)為是有效的天然自由基清除劑，可通過抑制自由基的生成，直接參與對(duì)自由基的清除、調(diào)節(jié)與自由基代謝相關(guān)的酶類來減輕自由基氧化損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以川芎揮發(fā)油為主要組方原料的通脈醒腦滴丸，能改善腦缺血后的組織損傷，減輕腦水腫，改善動(dòng)物的神經(jīng)功能癥狀，其機(jī)制與川芎揮發(fā)油降低缺血再灌注大鼠的腦組織MDA和NO的含量，升高SOD和GSH－Px的活性，改善自由基防御系統(tǒng)，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，也為川芎揮發(fā)油制劑臨床用于缺血性腦血管病的防治提供了藥理學(xué)依據(jù)。

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