清半夏炮制過程中化學(xué)物質(zhì)及刺激性變化研究

黃永亮，范靈婧，王雙雙，孫靈根，吳純潔

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternate(Thunb．)Breit．的干燥塊莖。具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)之功效［1］。其主要成分有生物堿、谷甾醇葡萄糖苷、胡蘿卜苷、草酸鈣、半夏蛋白、氨基酸、有機(jī)酸、無機(jī)元素、半夏胰蛋白酶抑制物、膽堿等［2］。

生半夏毒性較強(qiáng)，臨床上一般炮制后使用。將半夏礬制成清半夏可達(dá)到降低毒性的目的，即將生半夏經(jīng)8%白礬溶液浸泡至“口嘗微有麻舌感”。本文通過對清半夏炮制過程中物質(zhì)基礎(chǔ)及刺激性變化研究，揭示半夏礬制對其各種化學(xué)成分的影響，同時積極探討以生物評價法代替口嘗法確定炮制終點(diǎn)，從而達(dá)到保護(hù)工作人員，控制批次間穩(wěn)定性的目的。

1 實(shí)驗(yàn)材料

紫外－可見分光光度計(TU－1091，北京普析通用儀器公司)，氨基酸自動分析儀(835－50型，日本日立公司)。

生半夏(購于四川省新荷花飲片有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定)，10日齡SPF級雞胚(購于溫江正大畜禽有限公司)，臺盼藍(lán)(購于上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司)，磷酸生理鹽水溶液(自制)，甲酰胺、白礬、鹽酸、氫氧化鈉(購于成都科龍儀器化工有限公司)，所用試劑均為分析純，水為去離子水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試樣品的制備

清半夏的炮制:取大小一致的半夏，室溫條件下用8%白礬溶液浸泡，分別于規(guī)定時間點(diǎn)取樣適量，濾去白礬溶液，60℃烘干，粉碎，過篩，備用。

生半夏及其炮制品混懸液的制備:稱取一定量半夏粉末(過200目篩)，加水研磨，分別制成200 mg·50 mL－1、100 mg·50 mL－1濃度的混懸液。

2.2 雞胚尿囊膜試驗(yàn)［3］

配制含系列濃度臺盼藍(lán)的甲酰胺溶液(5×10－7mol·L－1，4×10－7mol·L－1，2.5×10－7mol·L－1，1×10－7mol·L－1，6×10－8mol·L－1)，在 595 nm 波長下測定其吸光度，以吸光度值(A)對臺盼藍(lán)的量(X/×10－7mol)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取10日齡SPF級雞胚，用手電筒照射確定雞胚氣室并沿氣室邊緣劃出其范圍，剝?nèi)サ皻?，暴露蛋殼膜，?～4滴水于蛋殼膜上，小心剝?nèi)サ皻つ?，暴露尿囊?CAM)。肉眼觀察CAM的完整性及有無出血點(diǎn)等變化，如有出血點(diǎn)或CAM破損則剔除，不能用于下一步試驗(yàn)。試驗(yàn)時，先加入適當(dāng)量磷酸生理鹽水(PBS)以緩沖其滲透壓，在CAM上放一硅膠環(huán)以固定接觸面積，將0.3 mL半夏混懸液加入硅膠環(huán)內(nèi)，作用2 min，然后用約20 mL生理鹽水輕柔沖洗至CAM表面干凈。5 min后，用0.4 mL的0.1%的臺盼藍(lán)通過硅膠環(huán)作用于CAM 1 min，過量的染料用蒸餾水漂洗至澄清。精確分離環(huán)面積內(nèi)已染色的CAM，用3 mL甲酰胺提取臺盼藍(lán)，放置1 h。用紫外－可見分光光度計于595 nm波長下測定其吸光度，并對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算臺盼藍(lán)的量。

以不同等級的國際標(biāo)準(zhǔn)刺激物:15%十二烷基磺酸鈉(強(qiáng)刺激性)、二甲亞砜(中度刺激性)、丙二醇(弱刺激性)為陽性對照;未處理的CAM的吸收值為空白對照;PBS為溶劑對照。

2.3 氨基酸含量測定

按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18246－2000，采用酸水解法中的常規(guī)水解法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定，檢測環(huán)境溫度:24℃。

2.4 有機(jī)酸含量測定

取不同炮制程度的清半夏粉末約5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，同上操作，再重復(fù)提取2次，放冷，濾過，合并濾液，蒸干，殘渣精密加入氫氧化鈉滴定液(0.1 mol·L－1)10 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加新沸過的冷水至刻度，搖勻，精密量取25 mL，按照電位滴定法測定，用鹽酸滴定液(0.1 mol·L－1)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 mL氫氧化鈉滴定液相當(dāng)于5.904 mg的琥珀酸(C4H6O4)。

2.5 白礬殘留量測定

取不同炮制程度清半夏粉末(過四號篩)約5 g，精密稱定，置坩堝中，緩緩熾熱，至完全碳化時，逐漸升高溫度至450℃，灰化4 h，取出，放冷，在坩堝中小心加入稀鹽酸約10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10 min，表面皿用熱水5 mL沖洗，洗液并入坩堝中，濾過，用水50 mL分次洗滌坩堝及濾渣，合并濾液及洗液，加0.025%甲基紅乙醇溶液1滴，滴加氨試液至溶液顯微黃色。加醋酸－醋酸銨緩沖液(pH 6.0)20 mL，精密加乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05 mol·L－1)滴定至溶液自黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，并將滴定液的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 mL的乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05 mol·L－1)相當(dāng)于23.72 mg的含水硫酸鋁鉀［KAl(SO4)2·12H2O］。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 雞胚尿囊膜染色試驗(yàn)

3.1.1 臺盼藍(lán)吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度值(A)對臺盼藍(lán)的量(X/×10－7mol)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.0676X+0.0034(R2=0.995)。證明經(jīng)甲酰胺溶解的臺盼藍(lán)在595 nm處的吸光度與臺盼藍(lán)的量具有很好的線性關(guān)系。

3.1.2 雞胚尿囊膜試驗(yàn)評價生半夏及其炮制品的刺激性

試驗(yàn)以國際標(biāo)準(zhǔn)刺激化學(xué)物質(zhì)為陽性對照，另設(shè)空白對照，評價生半夏及炮制品的刺激性。

三批雞胚尿囊膜染色試驗(yàn)結(jié)果見表1，刺激性變化趨勢圖見圖1。

試驗(yàn)結(jié)果表明濃度為100 mg·50 mL－1的半夏生品混懸液有明顯的刺激性，其細(xì)胞損傷強(qiáng)度與15%十二烷基磺酸鈉(SDS)相當(dāng)。而清半夏刺激性較生半夏以及國際標(biāo)準(zhǔn)刺激物質(zhì)中的強(qiáng)刺激性物質(zhì)15%SDS、中度刺激性物質(zhì)二甲亞砜弱，但其刺激性強(qiáng)于弱刺激性物質(zhì)丙二醇。

聚類分析將清半夏炮制過程0～72 h的樣品刺激性聚類分析成三類，結(jié)果顯示0～16 h半夏具有強(qiáng)刺激性作用，聚類中心為12.38;24～40 h半夏刺激性降低，為中度刺激性，聚類中心為10.28;48～72 h半夏刺激性顯著降低，為弱刺激性，聚類中心為4.51。

表1 五批清半夏不同炮制時間刺激性

圖1 清半夏炮制過程中刺激性變化趨勢

3.2 不同炮制時間樣品氨基酸含量

分別選取炮制時間為0 h、24 h、32 h和48 h的半夏炮制品，按氨基酸測定法測定17種氨基酸的含量，并得到氨基酸含量變化趨勢，結(jié)果見表2，變化趨勢見圖2。

表2 不同炮制時間清半夏各種氨基酸含量

圖2 炮制時間對清半夏氨基酸含量的影響

由分析結(jié)果可以看出，生半夏總氨基酸含量為4.16%，在清半夏炮制過程中，各種氨基酸含量的變化趨勢相似，都是先升高后降低。

3.3 不同炮制時間樣品有機(jī)酸含量

表3 不同炮制時間清半夏琥珀酸含量

圖3 清半夏琥珀酸含量隨炮制時間變化趨勢

分別選取不同炮制時間的清半夏樣品，按有機(jī)酸測定方法測定樣品中有機(jī)酸的含量，含總酸以琥珀酸計，結(jié)果見表3，其含量變化趨勢見圖3。

3.4 不同炮制時間樣品白礬含量

分別取不同炮制時間清半夏粉末5 g，精密稱定，按照白礬限量測定方法測定，并作出白礬含量隨炮制時間變化趨勢圖。隨著炮制時間增加，清半夏中白礬含量逐漸升高。結(jié)果見表4，圖4。

表4 不同炮制時間清半夏白礬含量

圖4 不同炮制時間清半夏白礬含量變化

4 結(jié)論與討論

清半夏的炮制，藥典要求浸泡至“口嘗微有麻舌感”，以達(dá)到降低毒性，減小刺激性的目的。實(shí)驗(yàn)證明白礬溶液浸泡能逐漸降低半夏的刺激性，口嘗結(jié)果表明，浸泡48 h以后可以達(dá)到藥典規(guī)定程度。傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)評價用口嘗法來判定炮制終點(diǎn)，帶有很大的主觀性，雞胚尿囊膜染色試驗(yàn)?zāi)芸陀^表征半夏的刺激性強(qiáng)度，通過分析可以確定“口嘗微有麻舌感”對應(yīng)的刺激性強(qiáng)度范圍，若將此方法應(yīng)用于炮制生產(chǎn)，建立生物評價法判定炮制終點(diǎn)，將有望取代傳統(tǒng)的人工口嘗，提高標(biāo)準(zhǔn)的客觀性，保證產(chǎn)品穩(wěn)定，在生產(chǎn)上有很好的應(yīng)用前景。

半夏富含17種氨基酸，生半夏中總氨基酸含量為4.16%。氨基酸是半夏的藥效物質(zhì)之一，對評價半夏的質(zhì)量有重要的參考價值。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在清半夏炮制過程中，各種氨基酸的含量變化趨勢均為先升高后降低。為了減少氨基酸類成分的損失，應(yīng)控制半夏炮制時間，不可為追求減毒而盲目延長炮制時間。

2010年版藥典規(guī)定生半夏按干燥品計算，含總酸以琥珀酸計，不得少于0.25%。清半夏含總酸以琥珀酸計，不得少于0.30%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，半夏炮制過程中有機(jī)酸含量呈緩慢下降趨勢，炮制48 h樣品的有機(jī)酸含量為0.35%，與文獻(xiàn)報道［4］白礬溶液能增加有機(jī)酸含量的結(jié)論不一致。由于半夏炮制過程變化復(fù)雜而緩慢，應(yīng)采取多批次測定，以揭示其含量變化的真正規(guī)律。

白礬中的鋁離子對人體有害，2010年版藥典規(guī)定了清半夏中白礬限量為10%。由于隨著炮制時間延長，白礬含量呈上升趨勢，所以應(yīng)控制合適的炮制時間，以減少清半夏中鋁離子的含量，保證用藥安全。

［1］ 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:110．

［2］ 杜貴友，方文賢．有毒中藥現(xiàn)代研究與合理應(yīng)用［M］．北京:中國中醫(yī)藥出版社，2000:413．

［3］ 張小琳，吳純潔，黃永亮．中藥半夏的刺激性評價－雞胚尿囊膜試驗(yàn)［J］．中國科技論文在線，2010:03．

［4］ 張琳，吳皓，朱濤，等．多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)化清半夏炮制工藝［J］．中成藥，2008，30(5):704．