均勻設(shè)計法在雞血紅素吸時提取中的應(yīng)用

區(qū)子弁，王 琴，何淑儀

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225)

均勻設(shè)計法在雞血紅素吸時提取中的應(yīng)用

區(qū)子弁，王 琴*，何淑儀

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225)

目的:借助均勻設(shè)計，確立雞血紅素吸附提取的最優(yōu)工藝。方法:以新鮮抗凝雞血為原料，經(jīng)超聲波溶血后，比較了pH、吸附時間、吸附劑添加量、吸附劑種類對雞血中血紅素提取的影響。結(jié)果:以血紅素得率為指標(biāo)，實驗的最優(yōu)條件為pH為5.2，吸附劑添加量2.4%(w/v)，吸附時間8h，選用CMC作吸附劑時，血紅素得率可達(dá)最大值2.848%(w/v);以血紅素純度為指標(biāo)，實驗的最優(yōu)條件為pH為4.8，吸附劑添加量3.1%(w/v)，吸附時間5h，選用CMC作吸附劑時，血紅素純度可達(dá)最大值3.04%(w/v)。

雞血紅素，均勻設(shè)計，吸附提取

血紅素為一種含鐵的卟啉類化合物，作為血紅蛋白的輔基，大量存在于人和哺乳動物血液的紅細(xì)胞中，起著運輸氧的重要功能。20世紀(jì)80年代初，人們開始應(yīng)用血紅素治療缺鐵性貧血，收到比傳統(tǒng)鐵制劑諸如硫酸亞鐵、富馬酸鐵、葡萄糖酸亞鐵等更顯著的療效［1］。同時開始對牲畜血中提取血紅素的方法進(jìn)行多方面的改進(jìn)［2－3］。血紅素作為預(yù)防和治療缺鐵性貧血的有效制劑，探索一種經(jīng)濟(jì)、簡便而高效的提取制備方法，一直被相關(guān)專業(yè)工作者所重視［4－5］。考慮到一些增稠劑具有獨特的吸附作用，且在吸附血紅素的同時其自身亦能作為食品的賦形劑，本文采用吸附法提取雞血紅素，并借助均勻設(shè)計優(yōu)化提取工藝，以求為雞血的深加工提供一種方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞血 購自廣州市遠(yuǎn)安路市場;血紅素標(biāo)準(zhǔn)品南京奧多福尼生物科技有限公司，純度≥98%;其他常規(guī)試劑 均為分析純。

TU－1810PC紫外－可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;PHS－3C精密pH計 上海精密儀器儀表有限公司;TDL－5－A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;DZF－250真空干燥機(jī) 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 血紅素制備 新鮮雞血加8g/L檸檬酸鈉做抗凝劑，攪拌均勻，3600r/min離心15min，傾出上清液，收集紅細(xì)胞，再用9g/L的生理鹽水洗滌紅細(xì)胞2次，離心取濃縮紅細(xì)胞。將干凈的紅細(xì)胞加入一定量的去離子水和乙醇，超聲波處理溶血后，過濾，沉淀部分用酸攪拌抽提，抽濾，濾液用NaOH溶液調(diào)pH至析出沉淀，加入吸附劑，靜置抽提，3600r/min離心，取沉淀，用等體積去離子水和無水乙醚分別洗滌2次，離心，真空干燥得粗品血紅素。

1.2.2 血紅素含量測定

1.2.2.1 血紅素最大吸收波長的測定 精確稱取血紅素標(biāo)準(zhǔn)品0.0200g，置于50mL燒杯中，用0.1mol·L－1NaOH溶解后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，另用同濃度的NaOH溶液分3次洗滌燒杯，洗滌液合并至容量瓶并稀釋至刻度，即成血紅素標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取血紅素標(biāo)準(zhǔn)貯備液2.0mL，置于10mL比色管中，用0.1mol·L－1NaOH定容，搖勻，即成血紅素標(biāo)準(zhǔn)供試液。設(shè)定紫外－可見分光光度計的波長范圍為300～540nm，掃描間距0.5nm。以0.1mol·L－1NaOH 溶液為空白，校正基線后向同一比色皿加入血紅素標(biāo)準(zhǔn)供試液，測定血紅素的最大吸收波長［6］。本標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)測定其最大吸收波長為396nm。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 血紅素標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備如1.2.2.1所述。然后精密量取血紅素標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分別置于 6 個 10mL 比色管中，用0.1mol·L－1NaOH 定容，搖勻，即成血紅素標(biāo)準(zhǔn)系列供試液。以0.1mol·L－1NaOH溶液為空白，在最大吸收波長下測定各自的吸光度。得回歸方程 y=0.01328x－0.00961，R2=0.9991。

1.2.2.3 血紅素樣品濃度的測定 精確稱取血紅素樣品約1g，置于50mL燒杯中，用0.1mol·L－1NaOH溶解后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，另用同濃度的NaOH溶液分3次洗滌燒杯，洗滌液合并至容量瓶并稀釋至刻度，即成血紅素樣品貯備液。精密量取血紅素樣品貯備液2.0mL，置于10mL比色管中，用0.1mol·L－1NaOH定容，搖勻，離心后取上層清液測定吸光度(以0.1mol·L－1NaOH 溶液做空白)。

1.2.2.4 血紅素提取工藝的均勻?qū)嶒炘O(shè)計 根據(jù)血紅素提取工藝的影響因素與水平，將按照U6(63×3)混合水平均勻設(shè)計表安排實驗，如表1所示。

表1 血紅素提取工藝的均勻設(shè)計實驗安排［U6(63×3)］

1.2.2.5 檢測指標(biāo) 考慮到最終產(chǎn)物血紅素的得率和純度均較為重要，故實驗的檢測指標(biāo)有兩個——血紅素得率和血紅素純度，其計算公式分別如下所示。在稱量吸附劑質(zhì)量變化前應(yīng)把沉淀物用等體積的無水乙醚、去離子水分別洗2次，離心后待無水乙醚完全揮發(fā)，再置于真空干燥箱內(nèi)烘干。

血紅素得率(%)=Δ(吸附劑吸附前后質(zhì)量變化)/樣品提取液初始體積×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 血紅素提取工藝的均勻設(shè)計實驗結(jié)果

按照表1的安排，所得實驗結(jié)果如表2所示。

表2 均勻設(shè)計實驗結(jié)果

2.2 均勻設(shè)計實驗結(jié)果分析

2.2.1 以血紅素得率為指標(biāo) 采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件中的多因子及互作項逐步回歸分析，結(jié)果如表3所示。得出回歸模型優(yōu)化表達(dá)式:y=－8.44617351+1.9005105425x1+7.391266004x2－1.2809120271x1x2－0.11691808024x2x4

此回歸方程相關(guān)系數(shù)R=0.999972，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù) Ra=0.999862，總體顯著性檢驗值 F=4531.9904，顯著水平達(dá)到p=0.0095，剩余標(biāo)準(zhǔn)差SSE=0.0142，因此該方程的可信度較高。同時根據(jù)方程對血紅素得率進(jìn)行預(yù)測，當(dāng)x1(pH)為5.2，x2(吸附劑添加量)=2.4%，x3(吸附時間)=8h，x4(吸附劑種類)為CMC時，得到y(tǒng)(血紅素得率)最大預(yù)測值為2.91%。

表3 均勻設(shè)計逐步回歸分析結(jié)果(以血紅素得率為指標(biāo))

根據(jù)回歸分析所得出的上述4個因素的最優(yōu)值重新組合并進(jìn)行優(yōu)化實驗，結(jié)果如表4所示。

表4 優(yōu)化實驗結(jié)果(以血紅素得率為指標(biāo))

由表4優(yōu)化實驗結(jié)果可知，實測平均值為2.848%，與模型預(yù)測值2.91%相差不大。通過t檢驗分析可知，t=－0.421 ＜t0.05(4)=2.776，p=0.695，因此，可知實測平均值與模型預(yù)測值沒有顯著差異，這進(jìn)一步說明回歸方程可信度較高。

因此，當(dāng)以血紅素得率為指標(biāo)，實驗的最優(yōu)條件為pH為5.2，吸附劑添加量2.4%(w/v)，吸附時間8h，選用CMC作吸附劑時，血紅素得率可達(dá)最大值2.848%(w/v)。

2.2.2 以血紅素純度為指標(biāo) 采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件中的多因子及互作項逐步回歸分析，結(jié)果如表5所示。

表5 均勻設(shè)計逐步回歸分析結(jié)果(以血紅素純度為指標(biāo))

得出回歸模型優(yōu)化表達(dá)式:y=2.328358804+1.5881594684x2－0.25747698149x1x2+0.018732162632x2x3－0.05806423034x3x4

此回歸方程相關(guān)系數(shù)R=0.999994，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù) Ra=0.999972，總體顯著性檢驗值 F=22479.8477，顯著水平達(dá)到 p=0.0050，剩余標(biāo)準(zhǔn)差SSE=0.0039，因此該方程的可信度較高。同時根據(jù)方程對血紅素得率進(jìn)行預(yù)測，當(dāng)x1(pH)為4.8，x2(吸附劑添加量)=3.1%，x3(吸附時間)=5h，x4(吸附劑種類)為CMC時，得到y(tǒng)(血紅素純度)的最大預(yù)測值為3.13%。

根據(jù)回歸分析所得出的上述4個因素的最優(yōu)值重新組合并進(jìn)行優(yōu)化實驗，結(jié)果如表6所示。

表6 優(yōu)化實驗結(jié)果(以血紅素得率為指標(biāo))

由表6優(yōu)化實驗結(jié)果可知，實測平均值為3.04%，與模型預(yù)測值3.13%很接近。通過t檢驗分析可知，t=－1.083 ＜t0.05(4)=2.776，p=0.340，因此，可知實測平均值與模型預(yù)測值沒有顯著差異，這進(jìn)一步說明回歸方程可信度較高。

因此，當(dāng)以血紅素純度為指標(biāo)，實驗的最優(yōu)條件:pH為4.8，吸附劑添加量3.1%(w/v)，吸附時間5h，選用CMC作吸附劑時，血紅素純度可達(dá)最大值3.04%(w/v)。

3 結(jié)論

確定用CMC－Na完成提取工藝階段的氯化血紅素提取。最佳工藝參數(shù)為:以血紅素得率為指標(biāo)，實驗的最優(yōu)條件為pH為5.2，吸附劑添加量2.4%，吸附時間8h;以血紅素純度為指標(biāo)，實驗的最優(yōu)條件為pH為4.8，吸附劑添加量3.1%，吸附時間5h。整個工藝過程成本低廉，且通過均勻設(shè)計準(zhǔn)確找出雞血紅素提取的最優(yōu)工藝，這最終為雞血的綜合深加工開辟一條可行之路。

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Application of uniform design on adsorbing extraction of chicken hemin

OU Zi－bian，WANG Qin*，HE Shu－yi
(College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China)

Objective:The optimal process of adsorbing extraction of chicken hemin was determined by uniform design.Methods:The fresh chicken blood added sodium citrate was used for extracting of heme.The parameters of extraction by pH，adsorbing time，types and additions of sorbent were compared.Results:Index by yield and purity of hemin，the optimal conditions were pH5.2 and 4.8，addition of sorbent were 2.4%and 3.1%，time of sorbent were 8h and 5h，respectively，and both of the type of sorbent was CMC.The yield of hemin was up to 2.848%(w/v)and the purity was 3.04%(w/v).

chicken hemin;uniform design;adsorbing extraction

TS201.2

B

1002－0306(2011)06－0304－03

2010－06－18 *通訊聯(lián)系人

區(qū)子弁(1985－)，男，在讀研究生，主要從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。

校創(chuàng)新基金項目(H1409008)。