復(fù)合酶水解豬血紅蛋白制備富血紅素多肽

楊萬(wàn)根，王衛(wèi)東，孫會(huì)剛，馬美湖

(1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

復(fù)合酶水解豬血紅蛋白制備富血紅素多肽

楊萬(wàn)根1，王衛(wèi)東1，孫會(huì)剛1，馬美湖2

(1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

以木瓜蛋白酶和AS1398中性蛋白酶組成的復(fù)合酶對(duì)豬血紅蛋白進(jìn)行水解，制備富血紅素多肽，考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶比例、水解pH值和水解溫度等因素對(duì)水解率、蛋白質(zhì)回收率、血紅素含量等指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響水解率和蛋白質(zhì)回收率指標(biāo)的最重要因素；pH值是影響血紅素含量指標(biāo)的最重要因素；復(fù)合酶水解豬血紅蛋白制備富血紅素多肽的最佳工藝條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、pH8、水解溫度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。在此工藝條件下，豬血紅蛋白水解產(chǎn)物具有較高的蛋白質(zhì)回收率和血紅素含量。

豬血紅蛋白；血紅素；多肽；復(fù)合酶；水解

我國(guó)生豬產(chǎn)量排名世界第一位，每年屠宰場(chǎng)產(chǎn)生的絕大多數(shù)豬血不經(jīng)利用而被直接排放入環(huán)境中，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。而豬血富含蛋白質(zhì)，其中的血紅蛋白由珠蛋白和血紅素兩部分構(gòu)成，是豬血中重要的營(yíng)養(yǎng)成分。研究證明，豬血紅蛋白多肽具有降血壓[1]、抗氧化[2]、抗菌[3]和增強(qiáng)人體免疫力[4]等多種生物活性，而血紅素或血紅素肽則是一種優(yōu)質(zhì)的補(bǔ)鐵營(yíng)養(yǎng)成分，與硫酸亞鐵補(bǔ)鐵劑相比，血紅素鐵的生物利用率高出23%[5]。因此，酶法水解豬血紅蛋白開(kāi)發(fā)富血紅素多肽產(chǎn)物具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和重要的環(huán)保意義。由于血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)致密，以及蛋白酶具有底物專一性，所以為獲得較好的水解效果，在實(shí)際生產(chǎn)中往往采用復(fù)合酶水解蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)木瓜蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行復(fù)配，研究復(fù)合酶水解豬血紅蛋白的最佳工藝條件，為富血紅素多肽產(chǎn)品的生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗血紅蛋白，自制：新鮮豬血抗凝處理，紗布過(guò)濾除去纖維蛋白，4000r/min離心15min，用生理鹽水清洗沉淀物，同樣轉(zhuǎn)速離心15min，重復(fù)兩次，沉淀物冷凍備用；木瓜蛋白酶(77.9kU/g蛋白質(zhì)) 廣州遠(yuǎn)天酶制劑廠；AS1398中性蛋白酶(25.7kU/g蛋白質(zhì)) 房山酶制劑廠；血紅素標(biāo)準(zhǔn)品(相對(duì)分子質(zhì)量651.96) 美國(guó)Sigma公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、EDTA、檸檬酸鈉、甲醛、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、硫酸銅 國(guó)藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；754型分光光度計(jì) 上海分析儀器廠；JB300-D型強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī)、DS-1型組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；PHS-3C型pH計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司；LD5-2型醫(yī)用離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬血紅蛋白水解液的制備工藝

用適量水稀釋豬血紅蛋白解凍液，85℃恒溫30min變性，搗碎，加水調(diào)節(jié)至預(yù)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的底物(蛋白質(zhì))濃度，加熱至水解溫度并調(diào)節(jié)至水解pH值，然后加入4000U/g蛋白質(zhì)的復(fù)合蛋白酶水解，水解過(guò)程中用pH計(jì)測(cè)定pH值，并滴加堿液保持pH值不變。水解10h后，調(diào)pH4.5，90℃加熱30min滅酶。4000r/min離心20min所得上清液即為豬血紅蛋白水解液。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9(34)正交試驗(yàn)[6]研究底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶比例(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)、水解pH值和溫度4種因素對(duì)水解率、蛋白質(zhì)回收率和血紅素含量等指標(biāo)的影響。試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。以最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表1 富血紅素多肽制備工藝正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

酶活：Folin-酚法[7]；氨基氮含量：甲醛滴定法[8]；總氮含量：微量凱氏定氮法[8]；血紅素含量：分光光度法[9]。

1.3.4 水解率的計(jì)算

1.3.5 蛋白質(zhì)回收率的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 水解率的考察

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 2 Orthogonal array design scheme, experimental results and range analysis

由表2極差分析可知，各因素對(duì)水解率指標(biāo)的重要性為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)＞溫度(D)＞pH(C)＞加酶比例(B)。各因素對(duì)水解率的影響如圖1所示，其中，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)各水平的優(yōu)劣為6%＞8%＞10%，隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，水解率下降；pH值各水平的優(yōu)劣為7.0＞7.5＞8.0，隨pH值增大，水解率下降；溫度各水平的優(yōu)劣為55℃＞50℃＞45℃，隨溫度升高，水解率增大；加酶比例以7:3的水解率最高，而比例9:1的水解率最低。所以，對(duì)水解率指標(biāo)來(lái)說(shuō)，最佳因素水平組合是底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、pH7、水解溫度55℃、加酶比例7:3(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

圖1 各因素對(duì)水解率的影響Fig.1 Effect of each factor on hydrolysis degree of porcine hemoglobin

隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，底物的流動(dòng)性變差，在10%的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)底物的流動(dòng)性最差，不利于酶連續(xù)水解底物蛋白質(zhì)，所以隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，水解率下降。木瓜蛋白酶主要作用于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鏈，將蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鍵切開(kāi)，生成相對(duì)分子質(zhì)量較大的肽段；AS1398蛋白酶則是一種微生物來(lái)源的水解酶，其水解專一性不強(qiáng)，水解產(chǎn)物以游離氨基酸和小肽為主，因此加酶比例9:1(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)的產(chǎn)物中的氨基氮含量比加酶比例7:3(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)產(chǎn)物中氨基氮含量低，故而水解率值小。董清平等[10]在比較堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解豬血能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，中性蛋白酶水解豬血產(chǎn)物的三氯乙酸可溶氮量大于木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的三氯乙酸可溶氮量，說(shuō)明形成的游離氨基酸和小肽數(shù)量大于木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物。因此，與木瓜蛋白酶相比，AS1398中性蛋白酶更有利于提高水解率指標(biāo)。

2.2 蛋白質(zhì)回收率的考察

表2中的R值顯示，各因素對(duì)蛋白質(zhì)回收率指標(biāo)的重要性為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)＞pH(C)＞溫度(D)＞加酶比例(B)。各因素對(duì)蛋白質(zhì)回收率的影響見(jiàn)圖2，圖中顯示底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%蛋白質(zhì)回收率最高，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%蛋白質(zhì)回收率最低，原因也與底物流動(dòng)性有關(guān)，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)大時(shí)底物流動(dòng)性差，不利于酶的作用；pH值各水平的優(yōu)劣為7.5＞7.0＞8.0，pH7.5為最佳水平是因?yàn)閜H7.5為中性蛋白酶的最適水解pH值[11]，在最適水解pH條件下中性蛋白酶的酶活最高，水解產(chǎn)生的可溶肽段數(shù)量最多。溫度各水平的優(yōu)劣為55℃＞45℃＞50℃，以55℃為最佳水平，這是因?yàn)樵谠摐囟认?，兩種酶的反應(yīng)速度最快。加酶比例各水平的優(yōu)劣為5:5＞7:3＞9:1?？梢钥闯?，隨中性蛋白酶在復(fù)合酶中所占的比例增大，蛋白質(zhì)回收率增大，這是由于中性蛋白酶的水解產(chǎn)物主要是可溶性的小肽和游離氨基酸組成，隨中性蛋白酶所占比例增大，水解物中可溶性小肽和游離氨基酸增多。因此，對(duì)蛋白質(zhì)回收率指標(biāo)而言，最優(yōu)水平組合是底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、pH7.5、溫度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

圖2 各因素對(duì)蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.2 Effect of each factor on protein recovery rate

2.3 血紅素含量的考察

由表2R值可知，pH值對(duì)血紅素含量指標(biāo)的影響最大，各因素對(duì)血紅素含量指標(biāo)的重要性為pH(C)＞溫度(D)＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)＞加酶比例(B)。各因素對(duì)血紅素指標(biāo)的影響如圖3所示。pH值各水平的優(yōu)劣為8.0＞7.5＞7.0，溫度各水平的優(yōu)劣為55℃＞50℃＞45℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)各水平的優(yōu)劣為8%＞10%＞6%，加酶比例(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)各水平的優(yōu)劣為5:5＞9:1＞7:3。血紅素含量隨pH值的升高而逐漸增加，原因是隨pH值升高，蛋白質(zhì)帶凈電荷數(shù)增加，靜電排斥力使蛋白質(zhì)分子展開(kāi)，原來(lái)埋藏在血紅蛋白分子內(nèi)部的血紅素暴露出來(lái)，與血紅素連接的肽鏈被酶水解的機(jī)會(huì)增加。李斌等[12]研究復(fù)合酶(中性蛋白酶:木瓜蛋白酶)水解豬血制備血紅素的最佳工藝條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶的最佳水解溫度56℃，最佳加酶比例(中性蛋白酶:木瓜蛋白酶)0.98:1，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。孫騫等[13]研究血紅蛋白酶法脫色時(shí)發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶水解液的色澤比AS1398中性蛋白酶水解液淺，說(shuō)明木瓜蛋白酶從豬血紅蛋白中釋放血紅素的能力比中性蛋白酶差。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中性蛋白酶所占比例最高時(shí)，血紅素含量最高，也說(shuō)明中性蛋白酶釋放血紅素能力比木瓜蛋白酶強(qiáng)。所以對(duì)血紅素指標(biāo)而言，最優(yōu)水平組合為pH8.0、溫度55℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

綜合考慮，由于對(duì)水解率和蛋白質(zhì)回收率指標(biāo)而言，pH值是非重要因素，為提高血紅素含量，以pH8作為復(fù)合酶的最佳pH值；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%為水解率、蛋白質(zhì)回收率兩指標(biāo)的最佳水平，而對(duì)血紅素含量指標(biāo)，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3水平之間效果相差不大，因此以6%為復(fù)合酶的最佳底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)；對(duì)水解率、蛋白質(zhì)回收率和血紅素含量3個(gè)指標(biāo)而言，溫度55℃都是最佳溫度；對(duì)蛋白質(zhì)回收率和血紅素含量指標(biāo)，加酶比例3水平之間效果相差不大，因此以水解率指標(biāo)的最佳加酶比例為復(fù)合酶的最佳比例，即5:5(木瓜蛋白酶:中性中性)。因此，復(fù)合酶水解豬血紅蛋白制備富血紅素多肽的最佳工藝條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、pH8、水解溫度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為產(chǎn)物的水解率17.5%，蛋白質(zhì)回收率59.2%，血紅素含量2.8mg/L。

圖3 各因素對(duì)血紅素含量的影響Fig.3 Effect of each factor on heme content

3 結(jié) 論

對(duì)影響水解率、蛋白質(zhì)回收率和血紅素含量3個(gè)重要指標(biāo)的影響因素進(jìn)行了研究，得到富血紅素多肽產(chǎn)物的最佳制備工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)水解率指標(biāo)，各因素的重要性為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)＞溫度(D)＞pH(C)＞加酶比例(B)；對(duì)蛋白質(zhì)回收率指標(biāo)，各因素的重要性為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)＞pH(C)＞溫度(D)＞加酶比例(B)；對(duì)血紅素含量指標(biāo)，各因素的重要性為pH(C)＞溫度(D)＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)＞加酶比例(B)。綜合考慮，復(fù)合酶水解豬血紅蛋白制備富血紅素多肽的最佳工藝條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、pH8、水解溫度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

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Preparation of Heme-rich Polypeptides from Porcine Hemoglobin by Enzymatic Hydrolysis

YANG Wan-gen1，WANG Wei-dong1，SUN Hui-gang1，MA Mei-hu2
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In order to prepare a heme-rich polypeptide product, mixed papain and neutral protease were used for the hydrolysis of porcine hemoglobin. The effects of substrate concentration, mixing ratio for papain and neutral protease, hydrolysis pH and hydrolysis temperature on hydrolysis degree, protein recovery rate and heme content were investigated. The results indicated that substrate concentration was the most important factor that affects hydrolysis degree and protein recovery rate. pH was the most important factor that affects heme content. The optimal hydrolysis conditions for the preparation of heme-rich polypeptide products were substrate concentration of 6%, pH 8, hydrolysis temperature of 55 ℃ and papain-to-neutral protease ratio of 5:5. Under the optimal preparation conditions, relatively high protein recovery rate and heme content for the hydrolysis of porcine hemoglobin were achieved.

porcine hemoglobin；heme；polypeptide；enzyme complex；hydrolysis

TS251.93

A

1002-6630(2011)06-0007-04

2010-04-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30270976)

楊萬(wàn)根(1974—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：yangwangen08@163.com