轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化對不同大豆蛋白凝膠性的影響

安 靜，于國萍*，初云斌，竇超然，姜巍巍

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化對不同大豆蛋白凝膠性的影響

安 靜，于國萍*，初云斌，竇超然，姜巍巍

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

研究轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對大豆分離蛋白和7S、11S球蛋白凝膠特性的影響，采用TA-XT plus物性測定儀、熒光分光光度計對各參數(shù)進行測定。結果表明：轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能夠顯著提高大豆蛋白凝膠的凝膠強度，最佳工藝條件為酶添加量40U/g、溫度40℃、pH7.5、作用時間2.5h，但此時凝膠表面疏水性和保水性有所下降。經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化后，不同蛋白形成熱處理凝膠的凝膠特性均發(fā)生顯著變化，凝膠強度均顯著增加，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化后大豆蛋白凝膠強度的順序為11S＞7S＞SPI。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；大豆分離蛋白；7S球蛋白；11S球蛋白；凝膠性

中國是大豆的起源地，也是大豆食品生產(chǎn)和消費大國。大豆含有約40%(干基)的蛋白質(zhì)，比任何一種糧食作物的蛋白質(zhì)含量都高，大豆蛋白已作為一種組分應用于各種食品[1]。7S和11S球蛋白是大豆分離蛋白(SPI)主要成分，它們有不同的功能性質(zhì)和結構。7S球蛋白具有良好的乳化性，11S球蛋白的凝膠性和起泡性較好，這些功能性質(zhì)對大豆分離蛋白的功能特性起著十分重要的作用，而含有大豆蛋白的制品質(zhì)地會受其功能特性的影響[2-3]。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)是一種?；D(zhuǎn)移酶，可催化相同或不同蛋白質(zhì)分子之間交聯(lián)與聚合，形成新的共價鍵[4]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以提高大豆分離蛋白的凝膠能力及性能。TGase催化SPI形成凝膠的主要作用是分子交聯(lián)形成的空間網(wǎng)絡結構[5-7]。目前，很多人都在研究轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對熱誘導大豆蛋白及其他蛋白凝膠特性的影響。而在國外，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)的高蛋白產(chǎn)品在市場已廣泛存在[8]。

本實驗以大豆蛋白為原料，研究轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對不同大豆蛋白凝膠強度、保水性和表面疏水性的影響，了解其變化規(guī)律，尋找其可能的變化機理，為改進大豆蛋白的功能性和應用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

轉(zhuǎn)谷胺酰胺酶[轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活力單位(U)定義為每分鐘產(chǎn)生lμmol氧肟酸所需酶量。本品實測為952U/g] 一鳴生物制品有限公司。1-苯胺基萘-8-硝基苯甲酸鹽(ANS) 美國Sigma公司；大豆分離蛋白(SPI)、低溫脫脂豆粉 哈高科大豆食品有限責任公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

TA-XT plus物性測定儀 英國Stable Micro System公司；650-60熒光分光光度計 日本島津公司；實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HJ-3恒溫磁力攪拌器 江蘇金壇市中大儀器廠；LD10-2.4A離心機 北京醫(yī)藥離心機廠。

1.2 方法

1.2.1 大豆7S和11S蛋白的提取和鑒定

依據(jù)Nagano法提取大豆7S和11S蛋白[9]。本實驗終產(chǎn)物7S和11S球蛋白采用凍干的方式制得，不同于Nagano法中的低溫干燥。凱氏定氮法測定大豆7S和11S球蛋白總蛋白含量(GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》)(蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)6.25)。

把SPI、7S和11S球蛋白作為樣品，同時，取酶催化后的不同大豆蛋白凝膠，加入到0.01mol/L pH7.0的磷酸緩沖液中，在室溫條件下，用磁力攪拌器緩慢攪拌2h，然后，將處理過的樣品在9000r/min離心15min，從3種凝膠中提取出的蛋白作為酶催化后的樣品。將各樣品加入到樣品緩沖液[0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)2mL、甘油2mL、20g/100mL的SDS 2mL、0.1g/100mL溴酚藍0.5mL、β-巰基乙醇1mL、重蒸水2.5mL]中，最終SPI和7S、11S球蛋白的質(zhì)量濃度是1mg/mL。標準蛋白質(zhì)Markers分子質(zhì)量14400～97400D。在80V和120V條件下，濃縮膠(4%)和分離膠(14%)(V/V)進行電泳實驗?？捡R斯亮藍(R-250)染色液染色。然后用脫色液(冰醋酸75mL和甲醇50mL，蒸餾水定容到1000mL)脫色。

1.2.2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化制備大豆分離蛋白凝膠

1.2.2.1 加酶量對大豆分離蛋白凝膠特性的影響

配制13g/100mL大豆分離蛋白分散液：以13g大豆分離蛋白分散在100mL水中，室溫條件下，用磁力攪拌器攪拌2h。大豆分離蛋白最終質(zhì)量濃度為13g/100mL。

將配制好的13g/100mL大豆分離蛋白分散液，調(diào)pH值到7.5，按蛋白質(zhì)量添加TGase量分別為0、10、20、30、40、50、60U/g，反應物于40℃反應0.5h。

制膠條件：將樣品在90℃加熱40min。然后，用冰水浴將凝膠迅速冷卻至室溫。最后，將樣品置于4℃冰箱過夜，用于凝膠性質(zhì)的測定。

1.2.2.2 反應溫度對大豆分離蛋白凝膠特性的影響

配制13g/100mL大豆分離蛋白分散液，調(diào)pH值到7.5，添加TGase量40U/g，反應物于30、40、50、60、70℃反應0.5h。按1.2.2.1節(jié)制膠條件，制備凝膠。

1.2.2.3 pH值對大豆分離蛋白凝膠特性的影響

配制13g/100mL大豆分離蛋白分散液，調(diào)pH值到5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，添加TGase量40U/g，反應物于40℃反應0.5h。按1.2.2.1節(jié)制膠條件，制備凝膠。

1.2.2.4 反應時間對大豆分離蛋白凝膠特性的影響

配制13g/100mL大豆分離蛋白分散液，調(diào)pH值到7.5，添加TGase量40U/g，反應物于40℃分別反應0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h。按1.2.2.1節(jié)制膠條件，制備凝膠。

1.2.3 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化大豆分離蛋白和7S、11S球蛋白后3種凝膠特性的比較

分別稱取不同量的大豆分離蛋白和7S、11S球蛋白原料(使三者純蛋白含量同為10.61%)，調(diào)pH值到7.5，添加TGase量為40U/g，反應物于40℃反應2.5h。按1.2.2.1節(jié)制膠條件，制備凝膠。

1.2.4 蛋白凝膠的凝膠強度的測定

依據(jù)Campbell等[10]測定方法，略有改動。樣品測定前在室溫條件下陳化1h即可測定。凝膠大小約為50mm(直徑)×25mm(高)。采用P/0.5柱形探頭，設定前進速度10mm/s，沖壓速度10mm/s；后撤速度10mm/s，沖壓深度10mm；一次測定過程中探頭下壓兩次。每個樣品重復3次測定過程，取平均值，得凝膠質(zhì)構參數(shù)。

1.2.5 蛋白凝膠的表面疏水性指數(shù)的測定[10-11]

取一塊不同方法制得的大豆蛋白凝膠，加入到0.01mol/L pH7.0的磷酸緩沖液中，在室溫條件下，用磁力攪拌器緩慢攪拌2h。然后，將處理過的樣品在9000r/min離心15min，取上清液備用。采用ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)熒光探針法，對大豆分離蛋白凝膠的表面疏水性指數(shù)進行測定，具體方法見文獻[11]。

1.2.6 蛋白凝膠保水性的測定

測定方法依據(jù)Gu等[12]的方法，略有改動。大豆蛋白凝膠在9000r/min離心20min。保水性(WHC)計算式如下：

式中：mt為凝膠樣品中所含水分的總質(zhì)量/g；mr為離心后凝膠溢出水分的質(zhì)量/g。

1.2.7 掃描電鏡分析(scanning electron microscopy，SEM)

依據(jù)Chin等[13]測定方法，取一塊凝膠(3mm×3mm×3mm)在體積分數(shù)2.5%的戊二醛溶液(用pH7.0的0.1mol/L磷酸緩沖液配制)中于4℃固定24h。用pH7.0的0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌10min(重復3次)。室溫，50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，每次10min。臨界點干燥，離子濺射，給樣品鍍金。掃描電鏡觀察，加速電壓5kV，觀測并拍攝樣品顆粒的外觀形態(tài)。

1.2.8 統(tǒng)計分析

每次實驗重復3次，所用數(shù)據(jù)均為3次的平均值，誤差項為標準差，數(shù)據(jù)均使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 各原料總蛋白含量

根據(jù)國標(GB/T 5009.5—2003)測定原料脫脂豆粉、大豆分離蛋白和本實驗制備的大豆7S和11S球蛋白的蛋白含量(濕基)，結果列于表1。

表1 原料成分表Table 1 Composition table of materials

2.2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化前后SPI和7S、11S球蛋白凝膠的SDS-PAGE電泳分析

圖1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化前后蛋白凝膠的電泳圖譜Fig.1 SDS-APGE of SPI and 7S, 11S proteins before and after treatment with TGase

根據(jù)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量與相對遷移率的關系，由圖1求出回歸方程為lgM＝－1.1925x＋5.2752，R2=0.9993。圖中7S球蛋白(泳道5)的電泳圖譜中3條主要的蛋白帶所對應的亞基相對分子質(zhì)量，從上至下依次為81000、72000和51000，與文獻報道的 7S球蛋白的3種亞基的相對分子質(zhì)量基本吻合[14]。大豆11S球蛋白，共12個亞基，具有6個酸性亞基(A1、A2、A3、A4、A5、A6)和 6 個堿性亞基(B1、B2、B3、B4、B5、B6)。圖1中11S球蛋白(泳道7)的電泳圖譜中3條主要的蛋白帶所對應的亞基相對分子質(zhì)量，從上至下依次為35000、34800、21000，分別與文獻報道的堿性亞基B的相對分子質(zhì)量為21000，酸性亞基A1、A2、A4、A5為34800，A3為35000相吻合[14]。從圖譜可以看出11S和7S球蛋白中含有少量的雜帶，但是11S和7S球蛋白相關的亞基已富集，可以認為它們己經(jīng)具有較高的純度，可以用于實驗。

加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶后，反應體系中聚合物的量不斷增加。由于TGase對大豆蛋白交聯(lián)聚合作用，使聚合物相對分子質(zhì)量增大，以至于不能很好進入分離膠而只能停留在濃縮膠與分離膠的界面上，即圖中頂端電泳區(qū)帶。

由電泳圖可知，經(jīng)TGase催化的大豆7S球蛋白(泳道4)的3個亞基電泳圖譜有較大變化。7S球蛋白的部分亞基條帶色澤變淡或消失；那些亞基聚合成了一些大分子聚合物而不能進入分離膠(即圖1頂端黑色條帶)。經(jīng)TGase改性后大豆11S球蛋白(泳道6)的酸性亞基的量近乎于消失，而堿性亞基幾乎都沒有明顯的變化，說明11S球蛋白的酸性亞基聚合生成了大分子蛋白聚合物，而TGase對11S蛋白堿性亞基幾乎沒有影響，出現(xiàn)這種結果可能是因為11S蛋白的堿性亞基被深深地包在大豆球蛋白的內(nèi)部，很難與TGase結合形成活化復合物。

2.3 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化對大豆分離蛋白凝膠強度的影響

2.3.1 酶添加量對大豆分離蛋白凝膠強度的影響

圖2 酶添加量對TGase催化大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.2 Effect of TGase addition amount on gel hardness of TGase-treated SPI gels

由圖2可知，隨著加酶量的增加，凝膠強度顯著增加；加酶量在40U/g時，凝膠強度達到最大；隨著加酶量繼續(xù)增加，凝膠強度有所下降。同時說明添加TGase對SPI凝膠強度有很明顯的改善作用，此時維系蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡穩(wěn)定所需的共價鍵的數(shù)目具有一定的飽和性。而過多的酶量反而不利于凝膠的空間網(wǎng)絡，原因可能是：加酶量大時，蛋白質(zhì)分子表面的作用位點可能會很快被交聯(lián)而降低了其與周圍其他蛋白質(zhì)分子進行交聯(lián)的機率，因而形成的分子間交聯(lián)要比加酶量小的情況下要少。而分子間的交聯(lián)對凝膠性起主要作用；分子內(nèi)交聯(lián)起的作用不大[5,17]。

2.3.2 溫度對大豆分離蛋白凝膠強度的影響

圖3 溫度對TGase催化大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.3 Effect of treatment temperature on gel hardness of TGase-treated SPI gels

由圖3可知，隨著酶反應溫度的增加，凝膠強度顯著增加；在40～60℃，沒有顯著變化；在70℃時，凝膠強度顯著下降。

溫度一方面影響酶反應的速度，另一方面影響酶活性。唐傳核等[15]報道，TGase的最適反應溫度為50～55℃。Ando等[16]曾報道，以氧肟酸為底物時，微生物TGase在pH7.0時，酶的最適反應溫度為40℃。本實驗與上述結論基本相符合。較高溫度條件下交聯(lián)反應速度很快，使得蛋白質(zhì)分子表面的作用位點很快被交聯(lián)而降低了此蛋白質(zhì)分子與其周圍蛋白質(zhì)分子進行分子間交聯(lián)的機率，因而分子間的交聯(lián)所占比例下降[5,15,17]。

2.3.3 pH值對大豆分離蛋白凝膠強度的影響

圖4 pH值對TGase催化大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.4 Effect of treatment pH on gel hardness of TGase-treated SPI gels

由圖4可知，在pH5.5～7.5范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，凝膠強度增加；在pH7.5時，凝膠強度最高；之后，隨著pH值繼續(xù)增加，凝膠強度顯著下降。說明pH5.5～8.5范圍內(nèi)對SPI凝膠強度產(chǎn)生很明顯的影響。

研究表明：TGase的最適pH值范圍是6.0～7.5，本實驗結果與之基本一致。體系pH值改變一方面影響酶活性和穩(wěn)定性；另一方面影響SPI的溶解性，影響蛋白質(zhì)相互作用過程中的疏水作用和靜電作用之間的平衡，進而影響凝膠的網(wǎng)狀結構。在極端pH值條件下，酶蛋白不穩(wěn)定發(fā)生空間構象改變而喪失活性；而pH值處于SPI的等電點(4～5)附近時，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷較少，易凝結成塊，無法形成有序的網(wǎng)狀結構[5,17]。

2.3.4 作用時間對大豆分離蛋白凝膠強度的影響

圖5 作用時間對TGase催化大豆分離蛋白凝膠強度的影響Fig.5 Effect of treatment time on gel hardness of TGase-treated SPI gels

由圖5可知，反應時間在0.5～2h，隨著反應時間的增加，凝膠強度變化不明顯，反應時間繼續(xù)增加，凝膠強度顯著增加；在2.5h時，凝膠強度達到最大；之后，呈現(xiàn)顯著下降趨勢。

反應時間也是影響酶促反應的重要因素，因此對SPI的凝膠性也必然產(chǎn)生較大的影響。隨酶促反應時間延長，底物不斷消耗，其濃度逐漸降低，酶也逐漸失活。所以，達到一定程度后催化速度必然減慢，SPI凝膠強度也呈現(xiàn)下降趨勢。

2.4 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化對大豆分離蛋白(SPI)和7S、11S球蛋白凝膠特性的影響

2.4.1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化對大豆分離蛋白和7S、11S球蛋白凝膠強度的影響

圖6 TGase催化對SPI和7S、11S球蛋白凝膠強度的影響Fig.6 Effect of TGase treatment on gel hardness of SPI and 7S, 11S gels

由如圖6可知，SPI和7S、11S球蛋白在90℃加熱40min后，11S球蛋白凝膠的凝膠強度遠遠超出SPI凝膠、7S凝膠。熱處理后的凝膠強度：11S＞SPI＞7S。經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化后的SPI、7S、11S球蛋白凝膠強度顯著增加。TGase催化后的凝膠強度11S＞7S＞SPI。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的添加，提高了大豆分離蛋白的凝膠能力及性能，酶導致的蛋白中疏水基團的暴露有利于在較低的蛋白濃度下形成網(wǎng)絡組織結構。TGase催化SPI形成凝膠的主要作用是分子交聯(lián)形成的空間網(wǎng)絡結構[5-7]。TGase催化大豆蛋白不同組分的速率是有所差異的，催化11S球蛋白聚合時，只能催化11S中的酸性亞基(acid subunits)聚合，而幾乎不影響11S的堿性亞基(basic subunits)，是由于11S球蛋白的結構特征所致，其酸性亞基似乎位于球狀結構的外部，而堿性亞基趨向于埋于內(nèi)部(疏水性更高)。與11S相對應，7S主要由α-、α′-以及γ-亞基組成，TGase似乎較難催化它聚合。大豆7S球蛋白具有緊密的空間結構，因而不是MTGase的較好底物，然而隨著TGase催化大豆11S球蛋白聚合較完全之后，它也會催化7S球蛋白緩慢聚合。另外，TGase導致大豆7S球蛋白聚合，導致它的空間結構松散，從而更有利于TGase的催化[18]。

TGase催化大豆蛋白(特別是11S)的反應溫度最好低于50℃。從某種程度上來說，較高溫度下聚合較短時間可達到較低溫度下較長時間的效果。盡管不同催化條件下聚合效果差不多，但是形成的生物聚合物的功能特性卻不一樣，較低溫度反應較長時間所形成的生物聚合物的聚合度較大[15]。

2.4.2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化對大豆分離蛋白和7S、11S球蛋白凝膠的表面疏水性指數(shù)的影響

圖7 TGase催化對SPI和7S、11S球蛋白凝膠表面疏水性的影響Fig.7 Effect of TGase treatment on surface hydrophobicity of SPI and 7S, 11S gels

由圖7可知，熱處理后的7S球蛋白凝膠的表面疏水性指數(shù)遠遠高于SPI和11S球蛋白。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化后的SPI、7S、11S凝膠的表面疏水性指數(shù)顯著降低。TGase催化后的凝膠的表面疏水性指數(shù)為7S＞SPI＞11S。大豆蛋白主要成分是11S和7S球蛋白，在中性pH條件下，其變性溫度分別為80℃左右和70℃左右，所以7S較11S更容易變性，其結構變得更松散，疏水基團外漏。

2.4.3 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化對大豆分離蛋白和7S、11S球蛋白凝膠保水性的影響

圖8 TGase催化對SPI和7S、11S球蛋白凝膠保水性的影響Fig.8 Effect of TGase treatment on water-holding capacity of SPI and 7S, 11S gels

由圖8可知，熱處理后的SPI、7S、11S三種蛋白凝膠保水性沒有顯著差異。經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化后的SPI、7S、11S凝膠表面疏水性略有下降，但也沒有顯著變化。

由SDS-PAGE圖可知，TGase催化大豆蛋白溶解性下降，經(jīng)TGase作用形成了較大的共價聚合物，親水性基團因相互聚合而減少，這對溶解性的下降起一定的作用。另有研究[5]發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGase催化后，其二級結構和三級結構逐漸打開，多肽鏈變的舒展，使原先埋藏于分子內(nèi)部的諸多疏水區(qū)域暴露于溶液，然而這種疏水區(qū)域在水溶液中是不穩(wěn)定的，它們會因相互疏水作用而凝集或聚合在一起，進而從溶液中析出而沉降。因TGase催化作用導致大豆蛋白溶解度下降，分子內(nèi)部的諸多疏水區(qū)域暴露，所以導致酶催化后各種蛋白凝膠的表面疏水性指數(shù)和保水性下降。

3 結 論

通過實驗確定了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的相關參數(shù)(酶添加量、作用溫度、pH值及反應時間)對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化大豆分離蛋白凝膠凝膠強度影響的變化規(guī)律。結果表明，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化顯著提高了大豆分離蛋白凝膠的凝膠強度，而酶催化后各種蛋白凝膠的表面疏水性指數(shù)和保水性有不同程度的下降。經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化后，大豆SPI、7S、11S球蛋白的凝膠強度變化幅度順序為11S＞7S＞SPI。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶主要催化大豆7S球蛋白和大豆11S球蛋白的酸性亞基發(fā)生交聯(lián)，而對大豆11S球蛋白的堿性亞基幾乎沒有影響。

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Effect of Transglutaminase on Characteristics of Soybean Protein Gels

AN Jing，YU Guo-ping*，CHU Yun-bin，DOU Chao-ran，JIANG Wei-wei
(School of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In order to explore the effect of transglutaminase (TGase) on the characteristics of soybean protein isolate (SPI),7S and 11S protein gels, the parameters of these TGase-treated protein gels were determined by TA-XT plus SEM (scanning electron microscope) and fluorescence spectrophotometer. Results indicated that gel hardness of TGase-treated SPI gels was significantly increased compared with that of the control. The optimal conditions of TGase treatment for SPI were TGase addition amount of 40 U/g, treatment temperature of 40 ℃, treatment pH of 7.5 and treatment time of 2.5 h. After treatment with TGase, the surface hydrophobicity and water-holding capacity of soy protein isolate gels exhibited a decrease. Meanwhile,heating treatment also resulted in a significant increase in the hardness of TGase-treated protein gels, and TGase-treated SPI gels had the largest gel intensity, followed by 7S and 11S in turn.

transglutaminase；soy protein isolate；7S；11S；gel characteristics

TS201.2

A

1002-6630(2011)06-0032-06

2010-04-21

國家“863”計劃項目(2006AA10Z322)；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(2006RFQXN014)

安靜(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為食品化學。E-mail：anjinganjing2008@yahoo.com.cn

*通信作者：于國萍(1963—)，女，教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：yuguopingneau@hotmail.com