肉中4種致病菌的P C R快速檢測方法的建立

劉紅玉，李 巖，崔洪斌

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086)

肉中4種致病菌的P C R快速檢測方法的建立

劉紅玉1，李 巖1，崔洪斌2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086)

目的：建立一種能同時(shí)檢測肉中金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌的多重PCR檢測方法。方法：根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)、沙門氏菌的侵襲蛋白基因(invA)、志賀氏菌的侵襲性質(zhì)?？乖?ipaH)和單核細(xì)胞增生性李斯特菌的內(nèi)化素基因(inlA)設(shè)計(jì)引物，通過優(yōu)化好的反應(yīng)體系進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的基因。結(jié)果：特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4種菌均能在相應(yīng)位置擴(kuò)增出特異性條帶。對(duì)污染4種菌的豬肉進(jìn)行檢測，確定出金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的檢出限是102CFU/mL，志賀氏菌和單核增生李斯特菌的檢出限是101CFU/mL。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立的多重PCR方法比傳統(tǒng)細(xì)菌檢測方法更特異、快速、靈敏，適用于肉中金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門菌和單核增生李斯特菌的快速檢測。

多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)；致病菌；肉；檢測

食源性致病菌是引起食源性疾病的重要原因，食源性疾病可以侵犯任何人群，兒童、孕婦、年老體弱者和免疫力低下的人群更容易感染食源性疾病，成為最主要的受害人群[1]，因此加強(qiáng)食品中致病微生物的檢測技術(shù)研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。傳統(tǒng)檢測方法檢測時(shí)間長、程序繁瑣，已無法滿足快速檢測的要求。近幾年常用的食源性致病菌的PCR檢測方法已被建立起來，如金黃色葡萄球菌[2]、志賀氏菌[3]、沙門氏菌[4]單核細(xì)胞增生李斯特氏菌[5]和大腸桿菌等，但是單一致病菌的PCR檢測技術(shù)和一般方法顯然都不能滿足對(duì)大批食品進(jìn)行致病菌快速檢測的需要，針對(duì)這種情況，建立了同時(shí)檢測多種致病菌的多重PCR技術(shù)，并且這種技術(shù)已經(jīng)有了很大發(fā)展[6]。本研究以金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)、沙門氏菌的侵襲蛋白基因(invA)、志賀氏菌的侵襲性質(zhì)?？乖?ipaH)和單核細(xì)胞增生性李斯特菌的內(nèi)化素基因(inlA)作為研究對(duì)象，建立一種靈敏性高、特異性好且穩(wěn)定的多重PCR體系，對(duì)快速、準(zhǔn)確的一次性檢測肉中4種致病菌感染狀況進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株由黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；新鮮豬肉 市購。

細(xì)菌基因組DNA試劑盒、dNTPs、DNA Marker DL2000 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；EZgeneTMTissue gDNA Kit(BIOMIGA)；10 × buffer(Mg2+Plus)、6×buffer、Taq酶 大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；50×TAE；Tris-HCl；EB；無水乙醇；TGRADIENT型PCR儀 德國Biometra公司；DYY-III型電泳儀 北京六一儀器廠；BTS-20.M凝膠成像系統(tǒng) 英國Uvitec公司。

擴(kuò)增的目的基因及引物設(shè)計(jì)：選擇金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因[7-8](nuc)、沙門氏菌的侵襲蛋白基因[9-10](invA)、志賀氏菌的侵襲性質(zhì)粒抗原基因[11-12](ipaH)和單核細(xì)胞增生性李斯特菌的內(nèi)化素基因[13-14](inlA)作為目的基因，用Primer 5分析軟件設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，由金思特(南京)有限公司合成(表1)。

表1 擴(kuò)增的目的基因及引物設(shè)計(jì)Table 1 Target genes and corresponding primer sequences

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)

在5mL新鮮無菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的制備

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 多重PCR擴(kuò)增

對(duì)引物添加量、dNTPs添加量、退火溫度、PCR循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最適反應(yīng)體系。最終確定反應(yīng)體系為50μL：10×buffer(Mg2+Plus)5μL，dNTPs(2.5mmol/L)5μL，上、下游引物(10mmol/L)各2μL，模板4μL，Taq酶1μL，其余用雙蒸水補(bǔ)足至50μL。PCR擴(kuò)增程序：采用熱啟動(dòng)。95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s；56℃退火45s；72℃延伸 1min；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。

1.2.4 特異性檢測

1.2.4.1 引物特異性檢測

從金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測引物特異性。

1.2.4.2 反應(yīng)特異性檢測

將金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌隨機(jī)進(jìn)行組合，提取DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增檢測多重PCR反應(yīng)特異性。

1.2.5 靈敏度檢測

將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌的單一菌液和4種菌的混合菌液分別用無菌的生理鹽水10倍稀釋，使4種菌的濃度均依次為107～100CFU/mL。根據(jù)細(xì)菌基因組DNA試劑盒說明書進(jìn)行，提取的DNA作為多重PCR反應(yīng)的模板。檢測單一致病菌的靈敏度和同時(shí)檢測4種致病菌的靈敏度。

1.2.6 多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測

取5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像。

1.2.7 多重PCR檢測人工污染的肉樣

挑選25g放入無菌樣品袋內(nèi)，加入225mL生理鹽水，均質(zhì)后，取出部分清液加入到滅菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基里，37℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌混合培養(yǎng)液，10倍稀釋，使?jié)舛纫来螢?07～100CFU/mL，分別接種于2.5g肉糜上，根據(jù)EZgeneTMTissue gDNA Ki說明書進(jìn)行，提取DNA作為多重PCR模板。利用已經(jīng)建立的多重PCR反應(yīng)程序進(jìn)行檢測，取5μL PCR產(chǎn)物在3% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像，確定4種致病菌在豬肉中的檢測限。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測

2.1.1 多重PCR引物特異性檢測

目標(biāo)菌株僅對(duì)其對(duì)應(yīng)引物有特異性反應(yīng)，在相應(yīng)位置出現(xiàn)了特征條帶，而對(duì)其他菌的引物沒有擴(kuò)增現(xiàn)象(圖 1)。

圖1 多重PCR引物特異性Fig.1 Specificity of multiplex PCR primers

圖1顯示，金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌均為陽性結(jié)果，均能在相應(yīng)位置擴(kuò)增出特異性條帶；其他的菌為陰性結(jié)果，沒有擴(kuò)增出特異性條帶；因此該引物特異性較強(qiáng)。

2.1.2 多重PCR反應(yīng)特異性檢測

將4種致病菌隨機(jī)組合，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)特異性檢測(圖 2)。

圖2 多重PCR反應(yīng)特異性Fig.2 Specificity of multiplex PCR reaction

由圖2可知，多重PCR反應(yīng)均能特異性的擴(kuò)增出目的片段。由此可知，該多重PCR方法特異性強(qiáng)，可同時(shí)檢測4種食源性致病菌的一種或幾種。

2.2 多重PCR反應(yīng)的靈敏度檢測

2.2.1 多重PCR檢測單一致病菌的靈敏度

將初始濃度均為107CFU/mL的4種菌分別10倍梯度稀釋，提取的DNA作為PCR反應(yīng)模板，確定多重PCR檢測單一致病菌的靈敏度。由圖3可知，多重PCR檢測4種單一致病菌的靈敏度均為101CFU/mL。

圖3 多重PCR分別檢測金黃色葡萄球菌(A)、沙門氏菌(B)、志賀氏菌(C)、單核增生李斯特菌(D)的靈敏度Fig.3 Sensitivity of multiplex PCR detection forStaphylococcus aureus(A),Salmonellaspp. (B),Shigellaspp. (C) andListeria monocytogenes(D)

2.2.2 多重PCR同時(shí)檢測4種致病菌靈敏度

初始濃度為107CFU/mL的4種混合菌液梯度稀釋，提取的DNA作為多重PCR反應(yīng)模板，確定多重PCR同時(shí)檢測4種致病菌的靈敏度(圖4)。

圖4 多重PCR同時(shí)檢測4種致病菌的靈敏度Fig.4 Sensitivity of multiplex PCR detection for four pathogens in meat

由圖4可知，多重PCR同時(shí)檢測4種致病菌的靈敏度為金黃色葡萄球菌為102CFU/mL、志賀氏菌為101CFU/mL、沙門氏菌為102CFU/mL、單核增生李斯特菌為101CFU/mL。

2.3 人工污染肉確定檢出限

從肉中提取的DNA按照優(yōu)化好的條件多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖5。

圖5 豬肉中4種致病菌多重PCR檢測Fig.5 Multiplex PCR detection of four bacterial pathogens in meat

由圖5可知，豬肉中多重PCR同時(shí)檢測4種致病菌的靈敏度為金黃色葡萄球菌為102CFU/mL、志賀氏菌為101CFU/mL、沙門氏菌為102CFU/mL、單核增生李斯特菌為101CFU/mL。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，多重PCR的優(yōu)化主要是優(yōu)化引物的合適配比、dNTP量、MgCl2濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中10×buffer中帶Mg2+(15mmol/L)，加入5μL的10×buffer后，體系中的Mg2+相當(dāng)于最適添加量，所以沒有優(yōu)化。只對(duì)引物添加量、dNTP量、退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，從中確定最適添加量。本研究的多重PCR技術(shù)具有很高的特異性，在很大程度上簡化了操作步驟，節(jié)省了試劑，并縮短了時(shí)間、降低了費(fèi)用，具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值[15]。本實(shí)驗(yàn)檢測的單一致病菌的靈敏度均達(dá)到101CFU/mL，而同時(shí)檢測4種致病菌的靈敏度時(shí)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的靈敏度是102CFU/mL，志賀氏菌和單核增生李斯特菌的靈敏度是101CFU/mL。說明多種因素對(duì)多重PCR的靈敏度有影響，包括引物的相互影響、引物退火溫度等。對(duì)于細(xì)菌量較少的檢測標(biāo)本，要經(jīng)過增菌，避免多重PCR出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

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Establishment of A Rapid Detection Method for Bacterial Pathogens in Meat by Polymerase Chain Reaction

LIU Hong-yu1，LI Yan1，CUI Hong-bin2
(1. College of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. College of Public Health, Harbin Medical University, Harbin 150086, China)

Objective: To establish a multiplex PCR for simultaneously detectingStaphylococcus aureus,Shigellaspp.,Salmonellaspp. andListeria monocytogenesin meat. Methods: The primers were designed according toStaphylococcus aureus nucgene,Shigellaspp.ipaHgene,Salmonellaspp.invAgene andListeria monocytogenesinlAgene. The target genes were amplified by multiplex PCR under optimized reaction conditions. Results: Four bacterial pathogens could be amplified, which revealed the special bands at the corresponding locations. When the meat samples were contaminated with four pathogens, the detection limits ofStaphylococcus aureusandSalmonellaspp. were 102CFU/mL, and the detection limits ofShigellaspp. andListeria monocytogeneswere 101CFU/mL. Conclusion: The established multiplex PCR method is more specific, rapid, and sensitive than traditional detection methods, which is suitable for the rapid detection of Staphylococcus aureus,Shigellaspp.,Salmonellaspp.andListeria monocytogenesin meat.

multiplex polymerase chain reaction (PCR)；pathogen；meat；detection

TS201.6

A

1002-6630(2011)06-0213-04

2010-04-12

黑龍江省科技廳資助項(xiàng)目(GA07B401)

劉紅玉(1970—)，女，副教授，博士，主要從事食品科學(xué)研究。E-mail：liuhongyu70@sohu.com