快速分離液相-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析大豆中的異黃酮成分

鄭振佳，初玉圣，遲炳海，王 曉,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014；3.山東龍大食品集團(tuán)有限公司，山東 煙臺(tái) 265231)

快速分離液相-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析大豆中的異黃酮成分

鄭振佳1,2，初玉圣3，遲炳海3，王 曉1,2,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014；3.山東龍大食品集團(tuán)有限公司，山東 煙臺(tái) 265231)

建立快速分離液相-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF)聯(lián)用技術(shù)分析大豆中的異黃酮的方法。大豆樣品經(jīng)甲醇超聲輔助提取后，選用Welch Materials C18柱，以乙腈-水(含0.1%甲酸)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明在正離子模式下，經(jīng)快速分離液相-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分離并檢測出9種異黃酮成分。RRLC-Q-TOF聯(lián)用技術(shù)可以快速準(zhǔn)確鑒定樣品中的異黃酮成分。

快速分離液相-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF)；大豆；異黃酮

大豆異黃酮是大豆中的重要生理活性物質(zhì)，以大豆異黃酮為活性成分的保健食品和功能食品逐漸為人們所接受[1-2]。研究證明：大豆異黃酮有預(yù)防癌癥、防止骨質(zhì)疏松、防止心血管疾病、抗炎、抗菌、抗衰老、抗氧化以及防止酒精中毒等生理活性，日本已將大豆異黃酮添加于食品中做為食品營養(yǎng)劑來使用[3-4]。目前發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮共有12種，分為游離型的苷元及其相應(yīng)的糖苷[5]。大豆異黃酮的檢測方法多采用紫外分光光度法(UV)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法(HPLC-MS)等[6-9]，分析過程依賴對(duì)照品且靈敏度不高，快速鑒定效果不理想。

高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜具有高分辨率，能夠不降低靈敏度而測定化合物的精確分子質(zhì)量[10-11]，對(duì)分子質(zhì)量數(shù)相差10-6的不同分子進(jìn)行有效區(qū)分，與液相色譜聯(lián)用是分析植物活性成分的有效方式，在天然產(chǎn)物分析方面越來越受到重視[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)采用快速分離液相-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，利用分子離子的精確質(zhì)量數(shù)，無需對(duì)照品，快速分析鑒定大豆中的異黃酮，旨在為快速評(píng)價(jià)大豆及其制品的品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆(粉碎至60目) 千佛山農(nóng)貿(mào)市場；Welch Materials C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)美國Welch Materials公司。乙腈(色譜純)；甲醇(分析純)；實(shí)驗(yàn)用水為去離子超純水。6520四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.2 樣品制備

精密稱取大豆粉末1.0g，放入50mL具塞試管中，加入10mL甲醇，室溫超聲提取15min，取上清液，過0.22μm濾膜，作供試樣品。

1.3 液質(zhì)聯(lián)用分析方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Welch Materials C18；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相梯度組成如表1所示；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：30℃；檢測波長：260nm。

表1 線性梯度洗脫表Table 1 Linear gradient elution of tetracyclines

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源ESI，四極桿溫度100℃，霧化壓力50psi，碎裂電壓175V，干燥器溫度350℃，干燥氣流量10L，毛細(xì)管電壓4000V，正離子模式掃描，掃描范圍m/z100～1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 Q-TOF條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別采用正、負(fù)兩種離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，優(yōu)化最佳分析條件以獲得最佳靈敏度。實(shí)驗(yàn)表明，正離子模式比負(fù)離子模式更加靈敏，因此本實(shí)驗(yàn)采用正離子模式進(jìn)行檢測。同時(shí)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入適當(dāng)甲酸更利于增強(qiáng)質(zhì)譜信號(hào)，從而提高靈敏度，考慮到酸性太強(qiáng)會(huì)對(duì)色譜柱有所損害，因此選擇在水中添加0.1%甲酸。

2.2 大豆中異黃酮成分的分析

圖1 大豆提取液的色相色譜圖(A)和總離子流圖(B)Fig.1 Rapid resolution liquid chromatogram (A) and total ion chromatogram (B) of soybean extract

圖2 異黃酮的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of soybean extract

經(jīng)四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀分析，大豆提取物的液相色譜圖和總離子流圖見圖1。

本實(shí)驗(yàn)所采用的高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜能夠得到待測組分的分子離子峰及其精確相對(duì)分子質(zhì)量，根據(jù)得到化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量，參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)各化合物進(jìn)行鑒別。根據(jù)圖2由文獻(xiàn)推斷大豆異黃酮的成分如下：

峰1(圖2a)獲得m/z417.22850[M+H]+質(zhì)譜信號(hào)，峰2(圖2b)獲得m/z447.12908[M+H]+質(zhì)譜信號(hào)，峰3(圖2c)獲得m/z433.11357[M+H]+質(zhì)譜信號(hào)，峰7(圖2g)獲得m/z271.06014[M+H]+質(zhì)譜信號(hào)，峰8(圖2h)獲得m/z255.06551[M+H]+質(zhì)譜信號(hào)，峰9(圖2i)獲得m/z285.07611[M+H]+質(zhì)譜信號(hào)，根據(jù)文獻(xiàn)[15]推斷其分別為大豆苷(C21H20O9)、黃豆黃苷(C22H22O10)、染料木苷(C21H20O10)、染料木素(C15H10O5)、大豆甙元(C15H10O4)和黃豆黃素(C16H12O5)。

峰4(圖2d)獲得m/z503.11949[M+H]+質(zhì)譜信號(hào)，峰5(圖2e)獲得m/z533.13013[M+H]+質(zhì)譜信號(hào)，峰6(圖2f)獲得m/z519.11411[M+H]+質(zhì)譜信號(hào)，根據(jù)文獻(xiàn)[14]推斷其分別為丙二?；蠖管?C24H22O12)、丙二?；S豆黃苷(C25H24O13)和丙二?；玖夏拒?C24H22O13)。

大豆中的異黃酮成分液相保留時(shí)間、質(zhì)譜分子離子峰、相對(duì)分子質(zhì)量實(shí)驗(yàn)測定值和理論值如表2所示，通過比較可以看出相對(duì)分子質(zhì)量實(shí)驗(yàn)測定值和理論值相差很小。

表2 大豆提取液中異黃酮的RRLC-Q-TOF分析Table 2 RRLC-Q-TOF analysis of isoflavonoids in soybean extract

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用快速分離液相-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，利用分子離子的精確質(zhì)量數(shù)，無需對(duì)照品，快速分析鑒定大豆中的異黃酮，對(duì)大豆的質(zhì)量控制、提取物指紋圖譜的建立及不同大豆品質(zhì)差異的分析檢測具有重要意義。所建方法對(duì)植物中黃酮類物質(zhì)的分析檢測提供了新的參考依據(jù)，對(duì)天然產(chǎn)物有效成分的定性分析具有重要的意義。

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Analysis of Isoflavonoids in Soybean by Rapid Resolution Liquid Chromatography-Quatrupole-Time of Flight Mass Spectrometry

ZHENG Zhen-jia1,2，CHU Yu-sheng3，CHI Bing-hai3，WANG Xiao1,2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China；2. Shandong Analysis and Test Center, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China；3. Shandong Longda Foodstuff Group Co. Ltd., Yantai 265231, China)

A novel method for the analysis of isoflavonoids in soybean was established by rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (RRLC-Q-TOF-MS). Samples were extracted with methanol under ultrasound assistance, and then a Welch Materials C18 column was applied in the RRLC separation using acetonitrile and water (0.1% formic acid) as the mobile phase. Elutes were detected by Q-TOF to obtain MS spectra with a positive ion mode.Nine isoflavonoids were identified. Therefore, this method can be used to rapidly determine isoflavonoids of soybean.

RRLC-Q-TOF；soybean；isoflavonoids

O657.63

A

1002-6630(2011)06-0233-04

2010-04-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20872083)；山東省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2009GG2001021-16)；

作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(20082KF05)

鄭振佳(1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離純化與活性。E-mail：pengyou-jia@163.com

*通信作者：王曉(1971—)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離純化與活性。E-mail：wangx@keylab.net