利用衍生化試劑D T N B測定枸杞中谷胱甘肽

朱亞玲，張小勇，崔勝云*

(延邊大學(xué) 長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 吉林 延吉 133002)

利用衍生化試劑D T N B測定枸杞中谷胱甘肽

朱亞玲，張小勇，崔勝云*

(延邊大學(xué) 長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 吉林 延吉 133002)

利用5,5＇-二硫硝基苯甲酸(DTNB)衍生化試劑和植物材料同步破壁提取的樣品處理方法，采用電噴霧質(zhì)譜法和分光光度法對枸杞中還原型谷胱甘肽(GSH)進(jìn)行定性、定量分析。枸杞樣品提取過程中GSH受破壁后胞外化學(xué)環(huán)境的影響導(dǎo)致氧化變性。利用5,5＇-二硫硝基苯甲酸(DTNB)衍生化試劑同步提取，因生成穩(wěn)定的GSH的衍生化產(chǎn)物避免了GSH氧化變性導(dǎo)致的GSH分析信息丟失。用 UV-Vis 分光光度法測定GSH含量，發(fā)現(xiàn)枸杞中含有豐富的GSH。標(biāo)準(zhǔn)加入法測定枸杞干品中GSH，其含量范圍達(dá)(6.56±0.54)mg/g，是目前所測植物樣品中GSH含量較高的物種。本研究對藥用植物胞內(nèi)活性物質(zhì)的準(zhǔn)確分析提供方法學(xué)的嘗試，并通過測定發(fā)現(xiàn)枸杞中富含GSH。

谷胱甘肽；5,5＇-二硫硝基苯甲酸；枸杞；分光光度法；質(zhì)譜分析法；同步衍生化

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是生物細(xì)胞內(nèi)具有較高濃度分布、含有半胱氨酸殘基的具有重要生物活性的三肽。由于谷胱甘肽的氧化型和還原型所組成電對的條件電位為－0.250V(vs.SHE)，說明GSH的巰基具有還原性[1-3]。因此，GSH只在細(xì)胞內(nèi)特定的氧化還原氛圍中穩(wěn)定存在并發(fā)揮其生物學(xué)功能。目前生物樣品中GSH的測定方法包括分光光度法[4-5]、谷胱甘肽還原酶循環(huán)法[6]、熒光分析法[7-9]、電化學(xué)分析方法[10-13]、色譜分析法[14-15]、毛細(xì)管電泳分析[16]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析[17]等。上述方法的樣品處理過程大多是先對樣品破壁提取后進(jìn)行測定。這種處理方法導(dǎo)致生物樣品破壁之后，胞內(nèi)的GSH受破壁后復(fù)雜的化學(xué)環(huán)境加上空氣等影響使其氧化變性或分解，給準(zhǔn)確分析GSH帶來困難。這也是目前許多具有重要生物活性的藥用植物都缺少GSH含量分析數(shù)據(jù)的原因之一。

本研究改進(jìn)通常的植物樣品前處理模式，利用含巰基衍生化試劑 DTNB的溶劑，采用衍生化和植物細(xì)胞破壁提取為一體的樣品處理操作。其目的是利用同步衍生化反應(yīng)生成穩(wěn)定的GSH衍生化產(chǎn)物來避免細(xì)胞破壁之后巰基受胞外其他化學(xué)環(huán)境影響導(dǎo)致的變性所帶來的準(zhǔn)確分析GSH的困難。由于本操作中胞內(nèi)的GSH在破壁的同時立刻與衍生化試劑生成穩(wěn)定的衍生化產(chǎn)物，可通過光度法和質(zhì)譜測定衍生化產(chǎn)物得到準(zhǔn)確、完整的植物樣品中GSH的定量及定性信息。本研究為準(zhǔn)確分析植物樣品中GSH含量提供了可靠的分析手段，這對富含GSH的藥用植物的篩選、GSH在藥用植物中的活性地位的評價等研究具有重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

寧夏產(chǎn)枸杞為市售的枸杞干品。還原型谷胱甘肽(99.0%)、5,5＇-二硫硝基苯甲酸(DTNB)(沃凱試劑99.0%)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

UV-2500PC紫外分光光度儀 日本島津公司； pHS-3C型實(shí)驗(yàn)室酸度計(jì) 上海洛奇特電子設(shè)備有限公司；HP1100-1946A LC-MS液-質(zhì)聯(lián)用儀；DC-3006低溫恒溫槽；80-2離心沉淀器；SG2200HE超聲波清洗器。

1.2 方法

1.2.1 植物材料的前處理和提取液的制備

將枸杞干品用蒸餾水淋洗、低溫烘干去掉水分。將枸杞干品用粉碎機(jī)粉碎至粗粉狀。取0.25g枸杞干粉，加入25mL含有一定濃度衍生化試劑(DTNB)的0.02mol/L PBS緩沖液(pH7)作為提取液，超聲振蕩破壁30min，離心，取上清液備用。取10mL上清液，加入2倍體積的乙醇，放置30min，然后在轉(zhuǎn)速5000r/min離心8min除蛋白。取離心后上清液，濃縮至10mL，用堿液調(diào)節(jié)酸度至中性(pH7.00)得光譜測定供試品溶液。供質(zhì)譜測定的植物材料提取液用蒸餾水代替PBS緩沖液，其他操作同上。

1.2.2 分析方法

GSH的定量分析是基于DTNB在pH7溶液中與巰基反應(yīng)，生成3-羧基-4-硝基苯硫酚，其離子呈黃色且在波長412nm處有強(qiáng)烈的吸收峰(本實(shí)驗(yàn)中在波長409nm處具有強(qiáng)吸收)。該吸收峰在過量的DTNB溶液中最大吸收波長處的吸收強(qiáng)度與加入的GSH濃度呈良好的線性關(guān)系。分別采用標(biāo)準(zhǔn)加入法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定GSH含量。

枸杞提取液中GSH定性分析是采用液質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜端口進(jìn)樣方法，通過檢測DTNB和GSH衍生化產(chǎn)物在m/z198和m/z503的特征分子離子峰來判斷GSH存在。質(zhì)譜測定條件為：離子源：ESI；碰撞電壓：70eV；干燥氣：N2；干燥氣流量：4L/min；干燥氣溫度：350℃；霧化器壓力：55psi；毛細(xì)管電壓：－3500V。

2 結(jié)果與分析

2.1 DTNB與GSH 混合溶液的光譜、質(zhì)譜測定

為了便于對實(shí)際樣品中 GSH 的定性和衍生化反應(yīng)機(jī)理的探討，分別對一定濃度的DTNB和該溶液中加入GSH后的混合溶液進(jìn)行UV-Vis光譜和電噴霧質(zhì)譜測定，結(jié)果見圖1。

圖1 DTNB、GSH及兩者混合溶液的UV-Vis吸收光譜和電噴霧質(zhì)譜圖(負(fù)離子模式)Fig.1 UV-visible and ESI-MS spectra (negative mode) of DTNB, GSH and mixture solution

圖 1A 表明：DTNB在λmax=323nm 處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，而在GSH和DTNB的濃度比為2:1的混合溶液中，由于衍生化作用使得DTNB在λmax=323nm處的吸收峰消失并在λmax=409nm處生成衍生化產(chǎn)物的新吸收峰。這一結(jié)果與文獻(xiàn)[18]報(bào)道相似，只是本實(shí)驗(yàn)條件下衍生化產(chǎn)物吸收波長略微不同(文獻(xiàn)[18]值為λmax=420nm)，說明GSH和DTNB衍生化作用產(chǎn)物，3-羧基-4-硝基苯硫酚在可見區(qū)有強(qiáng)吸收。圖1B、1D分別為DTNB、GSH和兩者混合溶液的電噴霧質(zhì)譜圖。DTNB和GSH分別在m/z395和m/z306處出現(xiàn)靈敏的脫質(zhì)子分子離子峰，而在兩者混合溶液中盡管在m/z395處仍能觀察到DTNB的脫質(zhì)子分子離子峰，但m/z306處的GSH的脫質(zhì)子分子離子峰完全消失，同時在m/z198和m/z503處分別出現(xiàn)GSH與DTNB的作用產(chǎn)物的脫質(zhì)子分子離子峰。根據(jù)上述光譜和質(zhì)譜測定結(jié)果推知，GSH與 DTNB作用生成如圖2所示的衍生化產(chǎn)物。

圖2 GSH與DTNB的作用產(chǎn)物Fig.2 Reaction products between GSH and DTNB

據(jù)文獻(xiàn)[19]報(bào)道，m/z198處的作用產(chǎn)物3-羧基-4-硝基苯硫酚在溶液中具有如圖3所示的負(fù)離子態(tài)的共振結(jié)構(gòu)，故在可見區(qū)具有較強(qiáng)的吸收光譜。因此，通過DTNB和巰基化合物的衍生化反應(yīng)定量生成3-羧基-4-硝基苯硫酚的顯色反應(yīng)，可利用UV-Vis分光光度法測定GSH的含量。

圖3 4-硝基苯硫酚化合物的共振結(jié)構(gòu)Fig.3 Resonance structure of 4-nitrophenyl phenolic sulfur compound

2.2 枸杞提取液中GSH的定性分析

基于DTNB 衍生化試劑的分光光度法測定GSH是根據(jù)巰基對DTNB中二硫鍵的還原作用生成3-羧基-4-硝基苯硫酚的顯色反應(yīng)。但這一方法對樣品中GSH沒有專一性，樣品中其他巰基化合物對測定有干擾[11]，故有必要對樣品中待測含巰基化合物骨架進(jìn)行定性分析。根據(jù)圖1、2結(jié)果可知，GSH與DTNB作用后，除了顯色物質(zhì)3-羧基-4-硝基苯硫酚外也生成GSH巰基與DTNB的二硫鍵通過氧化還原反應(yīng)生成的二硫鍵的交換反應(yīng)產(chǎn)物。因此，通過質(zhì)譜測定該交換反應(yīng)產(chǎn)物(對GSH來說在m/z503的質(zhì)譜峰)可準(zhǔn)確地對樣品中的含巰基化合物的分子骨架進(jìn)行定性。

為了探討枸杞中GSH含量信息和胞外化學(xué)環(huán)境對植物樣品中GSH的測定影響，采用如下兩種樣品處理方法獲取枸杞干品提取液并對其分別進(jìn)行質(zhì)譜和光譜測定。1)利用含有DTNB衍生化試劑的溶劑作為提取液，采用衍生化和超聲破壁同步進(jìn)行的方法獲取提取液；2)先用溶劑超聲破壁提取，然后往提取液中加入衍生化試劑。圖4為不同樣品處理方法得到的枸杞提取液的質(zhì)譜測定結(jié)果。

圖4 采用不同提取模式枸杞提取液的電噴霧質(zhì)譜圖(負(fù)離子模式)Fig.4 ESI-MS spectra of the extracts fromLycium barbarumL fruits obtained by different extraction methods

如圖4A所示，采用處理方法2得到的枸杞提取液在m/z 306處觀察不到GSH的脫質(zhì)子分子離子峰。當(dāng)該提取液中加入DTNB時(圖4B)，在m/z198處觀察到DTNB的還原產(chǎn)物3-羧基-4-硝基苯硫酚的分子離子峰，但觀察不到m/z503處GSH與3-羧基-4-硝基苯硫酚生成的二硫鍵交換反應(yīng)產(chǎn)物的分子離子，說明提取液中可能不含有完整的GSH分子形態(tài)的組分。比較圖4A、4B結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枸杞提取液在m/z337處出現(xiàn)豐度較高的質(zhì)譜峰，當(dāng)加入DTNB時，該峰幾近消失，同時在m/z198和m/z278處分別出現(xiàn)DTNB被還原成3-羧基-4-硝基-苯硫酚的脫質(zhì)子分子離子峰和DTNB的二硫鍵中一個硫原子被磺酸化的產(chǎn)物脫質(zhì)子分子離子峰。根據(jù)氮規(guī)則和相對分子質(zhì)量推斷為GSH的巰基被氧化成亞磺酰胺的產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)見圖4B。由此可推斷：枸杞提取液中m/z337的質(zhì)譜峰所對應(yīng)的物質(zhì)是樣品處理過程中GSH的半氧化變性產(chǎn)物，該產(chǎn)物可能也對DTNB的二硫鍵具有一定的氧化作用，生成顯色物質(zhì)3-羧基-4-硝基-苯硫酚。圖4C為含有DTNB的溶劑同步提取液的質(zhì)譜圖，從圖4C可知除了m/z198處出現(xiàn)3-羧基-4-硝基硫酚的分子離子峰之外，在m/z503處也可觀察到GSH的巰基與DTNB的二硫鍵交換反應(yīng)產(chǎn)物的脫質(zhì)子分子離子峰，說明枸杞提取液中初始含有完整的GSH分子形態(tài)。

圖5 采用不同提取模式的枸杞提取液的UV-Vis吸收光譜圖Fig.5 UV-visible spectra of extracts ofLycium barbarumL fruits obtained by different extraction methods

圖5 為方法1和方法2兩種處理方法得到的枸杞提取液的UV-Vis吸收光譜圖。結(jié)果表明，方法1得到的枸杞提取液[圖5(1)]在λmax=409nm處的吸收光譜的強(qiáng)度明顯大于方法2得到的枸杞提取液的吸收光譜強(qiáng)度，說明同步提取有利于胞內(nèi)GSH在破壁的同時立刻與DTNB作用生成衍生化顯色產(chǎn)物。

從上述討論中可推斷：植物細(xì)胞破壁和DTNB衍生化同步進(jìn)行的提取方法中，因細(xì)胞破壁的同時DTNB與胞內(nèi)GSH立刻生成相對穩(wěn)定的衍生化產(chǎn)物，故切斷了GSH破壁后的氧化修飾或變性。因此，通過對生成的穩(wěn)定衍生化產(chǎn)物的光譜或質(zhì)譜測定可得到完整的GSH的分析信息。若采用先破壁后衍生化的提取方法，因只在胞內(nèi)特定氧化還原氛圍中穩(wěn)定的GSH在破壁后的新的化學(xué)環(huán)境中(其中包括各種細(xì)胞器內(nèi)的酶等物質(zhì))易發(fā)生氧化修飾或其他的分解反應(yīng)，故得不到完整的GSH分析信息。

2.3 分光光度法定量測定枸杞中的GSH

2.3.1 GSH 濃度與顯色物吸光度的線性范圍

為了考察G S H的濃度和衍生化顯色物質(zhì)在λmax=409nm處的吸光度的線性范圍，分別在一定濃度的DTNB溶液中依次加入不同濃度比的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液并測得UV-Vis吸收光譜，結(jié)果見圖6。

圖6 DTNB溶液中加入不同濃度GSH溶液后測得的UV-Viss吸收光譜圖Fig.6 UV-visible spectra of different amounts of GSH in DTNB solution

圖6 表明，當(dāng)恒定DTNB濃度為一定時(2×10-5mol/L)，隨著加入GSH濃度的增加，λmax=409nm處的吸光度在GSH和衍生化試劑DTNB濃度比小于2時，吸光度與GSH濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為A409=0.0044＋0.12565C，相關(guān)系數(shù)r=0.9975，當(dāng)GSH與DTNB濃度比超過2時，λmax=409nm處的吸光度反而降低。加入的GSH濃度和λmax=409nm處的吸光度關(guān)系曲線見圖7。

圖7 波長409nm處的吸光度與GSH濃度間的校正曲線Fig.7 Calibration curve between absorbance at 409 nm and GSH concentration

由圖7可知，GSH與衍生化產(chǎn)物在λmax=409nm處的吸光度在GSH和DTNB濃度比小于或等于2時呈良好的線性關(guān)系。而當(dāng)其濃度比大于2時，過量的GSH與前期作用產(chǎn)物3-羧基-4-硝基苯硫酚之間發(fā)生明顯的相互作用導(dǎo)致后者的吸光度降低。這可能是由于GSH與DTNB的作用是兩步反應(yīng)(圖8)。

圖8 GSH和DTNB的反應(yīng)機(jī)理Fig.8 Reaction mechanism between GSH and DTNB

如圖8所示，第一步反應(yīng)中兩分子GSH與一分子DTNB 反應(yīng)生成兩分子的衍生化產(chǎn)物(Ⅰ)，然后該產(chǎn)物再與兩分子GSH作用生成兩分子2,3-羧基-4-硝基苯硫酚(Ⅱ)和兩分子氧化型谷胱甘肽(GSSG)[18]。由于GSH和吸光產(chǎn)物(Ⅱ)的反應(yīng)計(jì)量關(guān)系為2:1，故在一定濃度的DTNB溶液中，當(dāng)GSH和DTNB濃度比小于2時，顯色產(chǎn)物(Ⅱ)的量隨GSH的濃度的增加而線性增加。而當(dāng)GSH和DTNB的濃度比大于2時，由于過量的GSH和顯色產(chǎn)物(Ⅱ)的巰基相互作用生成在可見區(qū)無吸收的產(chǎn)物(Ⅰ)，從而導(dǎo)致可見光區(qū)(λmax=409nm) 的吸光度反而減小(圖 7)。

2.3.2 枸杞中GSH含量的測定

分別采用改進(jìn)的提取方法對枸杞提取液采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法分別測定了枸杞中的GSH含量，并與采用熒光法測定結(jié)果進(jìn)行比較。

圖9 枸杞提取液及其加入GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液測得的UV-Vis吸收光譜圖Fig.9 UV-visible spectra ofLycium barbarumL extract with extra amount of DTNB and GSH standard solution at various concentrations

如圖9所示，含有DTNB的枸杞提取液在λmax=409nm處具有明顯的吸收，說明提取液中含有GSH。當(dāng)該提取液中加入GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液時，λmax=409nm處的吸光度隨加入的GSH的濃度呈線性增加，加入法的線性校正曲線見圖10。

圖10 標(biāo)準(zhǔn)加入法校正曲線Fig.10 Calibration curve for standard addition method

圖10 表明，利用含DTNB溶劑的枸杞提取液溶液在λmax=409nm處的吸光度隨加入的GSH的濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為A=0.3091＋0.0150C，相關(guān)系數(shù)r=0.9983。利用衍生化產(chǎn)物在λmax=409nm吸光度與GSH濃度的線性關(guān)系分別用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法測定了枸杞中GSH含量并與采用文獻(xiàn)[8-9]所提及的熒光光譜測定結(jié)果進(jìn)行對照，結(jié)果見表1。

表1 枸杞中GSH含量分析結(jié)果(n=5)Table 1 GSH determination results inLycium barbarumL fruits (n=5)

從表1可知，標(biāo)準(zhǔn)加入法測定枸杞中GSH含量范圍在(6.56±0.54)mg/g、標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定其含量范圍為(7.37±0.62)mg/g，兩者結(jié)果與熒光光譜法測定結(jié)果(6.72±0.62)mg/g基本吻合。

3 結(jié) 論

3.1 利用DTNB衍生化試劑同步提取植物細(xì)胞內(nèi)的GSH方法，采用分光光度法成功測定了枸杞樣品中GSH含量。通過與刺五加、五味子等其他植物比較篩選后發(fā)現(xiàn)枸杞樣品含有較高的GSH含量，標(biāo)準(zhǔn)加入法測定其干品含量范圍達(dá)(6.56±0.54)mg/g，是目前所報(bào)道植物[20-21]中GSH含量最高的一種藥用植物。

3.2 DTNB衍生化法測定植物樣品中GSH與樣品前處理過程具有至關(guān)重要的關(guān)系。質(zhì)譜測定結(jié)果表明，由于GSH只在細(xì)胞內(nèi)特定的氧化還原氛圍中穩(wěn)定存在，當(dāng)細(xì)胞破壁時會受到胞外化學(xué)環(huán)境的影響導(dǎo)致氧化變性，從而導(dǎo)致無法準(zhǔn)確測定其含量，甚至導(dǎo)致漏檢。

3.3 采用DTNB同步提取的植物樣品前處理方法使胞內(nèi)的GSH在破壁瞬間與衍生化試劑生成穩(wěn)定的衍生化顯色產(chǎn)物。因此，通過光譜測定可獲得胞內(nèi)完整、準(zhǔn)確的GSH的含量信息。本研究對富含GSH植物種的篩選、植物生理、GSH在藥用植物中的地位研究提供方法學(xué)上的可靠依據(jù)。

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Determination of GSH inLycium barbarumL Fruits by Derivatizing Agent

ZHU Ya-ling，ZHANG Xiao-yong，CUI Sheng-yun*
(Key Laboratory of Natural Resources of Changbai Mountain & Functional Molecules，Ministry of Education,Yanbian University, Yanji 133002, China)

The content of reduced glutathione (GSH) inLycium barbarumL fruits was determined by mass spectroscopy and UV-visible spectroscopy using 5,5＇-dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) as the simultaneous derivatizing agent. GSH inLycium barbarumL fruits was significantly affected by extracellular chemical environment during sample treatment. Extraction with DTNB as the simultaneous derivatizing agent inhibited the transformation or decomposition of GSH due to immediate derivatization during sample treatment. Quantitative determination results indicated thatLycium barbarumL fruits contained GSH in the range of (6.56±0.54) mg/g, which was one of the most GSH-abundant plant species.

glutathione；5,5 ＇-dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB)；Lycium barbarumL；mass spectroscopy；simultaneous derivatization

O657

A

1002-6630(2011)06-0250-06

2010-06-03

朱亞玲(1984—)，女，碩士，研究方向?yàn)橛袡C(jī)分析。E-mail：136584711@qq.com

*通信作者：崔勝云(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橛袡C(jī)分析。E-mail：sycui820@yahoo.com.cn