花生主要過(guò)敏原Ara h1的純化

吳序櫟，肖 杰，劉志剛,*，呂志平，劉駿杰

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.深圳大學(xué)過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，廣東 深圳 518060；3.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 深圳 518060)

花生主要過(guò)敏原Ara h1的純化

吳序櫟1,2，肖 杰2，劉志剛2,*，呂志平3，劉駿杰2

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.深圳大學(xué)過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，廣東 深圳 518060；3.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 深圳 518060)

采用硫酸銨沉淀及凝膠過(guò)濾層析方法，純化花生主要過(guò)敏原蛋白Ara h1，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)結(jié)合免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western-Blotting)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：可純化出純度90%以上的Ara h1過(guò)敏原蛋白。

花生；Ara h1；蛋白；純化；過(guò)敏

食物過(guò)敏是食品工業(yè)面臨的重要安全問(wèn)題之一，食品過(guò)敏反應(yīng)主要是由IgE介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可能產(chǎn)生過(guò)敏性休克，甚至危及生命[1]?；ㄉ侵匾氖澄镞^(guò)敏原之一，美國(guó)的食物過(guò)敏癥90%以上由花生、堅(jiān)果類、魚類、甲殼類、乳類、小麥、大豆和蛋類引起[2]，歐洲的食物過(guò)敏癥主要由牛奶、蛋、花生、堅(jiān)果、魚、甲殼類、大豆、芝麻和小麥引起[3]。我國(guó)一項(xiàng)臨床研究表明，過(guò)敏性哮喘病人的過(guò)敏食物種類以油料類食物居首位，如花生、芝麻、黃豆等；高蛋白類動(dòng)物食品占24.5%[4]?；ㄉ^(guò)敏原包括多種蛋白質(zhì)組分，它們高度糖基化，分子質(zhì)量介于0.7～100kD之間，分別屬于不同的蛋白質(zhì)家族，其中Ara h1(vicilin)被認(rèn)為是主要的花生過(guò)敏原，90%的花生過(guò)敏患者對(duì)其過(guò)敏[5]。隨著人們對(duì)食品安全認(rèn)識(shí)的深入，花生過(guò)敏原的研究在我國(guó)也逐漸得到重視。食品過(guò)敏原蛋白的分離純化是開(kāi)展食品過(guò)敏原蛋白研究的前提。為深入研究花生過(guò)敏原和研制低致敏花生制品，必需首先獲得高純度的花生過(guò)敏原蛋白。本研究以花生為實(shí)驗(yàn)材料，采用脫脂、硫酸銨沉淀及凝膠過(guò)濾層析方法，純化出花生主要過(guò)敏原蛋白Ara h1，并進(jìn)行免疫活性鑒定，為開(kāi)展Ara h1蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究，及探討各種食品加工過(guò)程對(duì)其致敏性的影響提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清與原料

本研究所用的血清來(lái)自于10個(gè)有花生過(guò)敏史的患者，所有患者血清都由?？谑腥嗣襻t(yī)院提供并儲(chǔ)存于－80℃?zhèn)溆?血清IgE檢測(cè)為2級(jí)以上)，花生為國(guó)產(chǎn)魯花9號(hào)。

1.1.2 試劑與儀器

生物素標(biāo)記羊抗人IgE抗體 美國(guó)KPL公司；鏈霉親和素(HRP) 美國(guó)Vector公司；HiTrap protein A、HiTrap Desalting F F、DEAE-SepharoseF F硝酸纖維素膜 美國(guó)Amersham Pharmacia公司；其他常用試劑購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

垂直板型電泳槽、model 1000/500轉(zhuǎn)膜電泳槽、常壓層析控制系統(tǒng) 美國(guó) Bio-Rad公司；凝膠成像及分析系統(tǒng) 法國(guó)Vilber Lourmat公司；層析柱 美國(guó)GE公司。

1.2 方法

1.2.1 花生蛋白的粗提

取花生反復(fù)凍融后用研缽研磨，得花生粉末。用預(yù)冷丙酮和乙醚于4℃交替去脂，直到上清液澄清為止，用吸管盡量吸干丙酮和乙醚并在通風(fēng)櫥中風(fēng)干。按每克樣品7mL加入PBS緩沖液進(jìn)行蛋白提取，4℃磁力攪拌24h。提完后用冷凍離心機(jī)在15000r/min，4℃條件下離心15min，上清液即為過(guò)敏原粗提液。取上清液用PBS緩沖液透析(透析帶截流范圍為6～8kD)1d，期間換液4次。透析完后，取50mL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，剩余的樣品經(jīng)分裝后放入－80℃冰箱保存。

1.2.2 硫酸銨分級(jí)沉淀

取10mL花生蛋白粗提液，在粗提液中逐步加入固體硫酸銨，使其充分溶解，先使硫酸銨飽和度達(dá)到30%，12000r/min離心10min，沉淀用100μL 雙蒸水溶解，4℃保存；在上清液中再加入硫酸銨使硫酸銨飽和度達(dá)到70%，12000r/min離心10min，沉淀用100μL雙蒸水溶解，4℃保存；同樣操作使硫酸銨飽和度達(dá)到100%。

1.2.3 凝膠過(guò)濾層析法提取過(guò)敏原Ara h l

在BIO-RAD常壓層析控制系統(tǒng)下，先用Superdex 200凝膠過(guò)濾層析柱純化樣品，以Tris緩沖液充分平衡系統(tǒng)后將硫酸銨分級(jí)沉淀后的花生蛋白上樣，收集各峰液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將收集的蛋白再用Superdex 75凝膠過(guò)濾層析柱純化，以Tris緩沖液充分平衡系統(tǒng)進(jìn)樣，收集各峰液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并通過(guò)免疫印跡鑒定純化后蛋白的免疫活性。

1.2.4 SDS-PAGE電泳分析

采用不連續(xù)體系SDS-PAGE電泳平板凝膠，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，恒流電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色、醋酸脫色。

1.2.5 免疫印跡法鑒定過(guò)敏原

取含200μg蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完取出SDS-PAGE凝膠，按凝膠的大小剪取NC膜，將膠和膜放入電轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20min后，在350mA恒流條件下，于4℃冰箱中電轉(zhuǎn)40min。NC膜用2% BSA封閉2h后，加入過(guò)敏病人的陽(yáng)性混合血清(按1:10稀釋)。搖床上搖2h后放入4℃冰箱過(guò)夜，將NC膜轉(zhuǎn)入生物素標(biāo)記羊抗人IgE抗體(按1:1000稀釋)中搖2h。鏈霉親和素(HRP)按1:500稀釋后將NC膜放入其中搖2h。最后DAB顯色，待條帶清晰后即用水沖洗，終止顯色反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生粗提液蛋白的SDS-PAGE

圖1 花生粗提液蛋白SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE of total protein in crude extract from peanut

如圖1所示，花生粗提液蛋白條帶至少有10條，蛋白條帶分子質(zhì)量分別為：98、63、42、39、30、28、23、20、18、15kD，其中含量高的有6條，分子質(zhì)量分別為：63、30、28、20、18、15kD，其中以63kD處最為富集，63kD以下蛋白多且分布均勻。

2.2 花生粗提液蛋白免疫印跡結(jié)果

選用臨床對(duì)花生過(guò)敏患者的陽(yáng)性混合血清為一抗進(jìn)行免疫印跡(Western-Blotting)鑒定。結(jié)果顯示(圖2)，花生過(guò)敏條帶主要有7條，分子質(zhì)量分別為98、79、76、63、42、39、15kD。

圖2 花生過(guò)敏原免疫印跡鑒定圖Fig.2 Identification of peanut allergens by Western-Blotting analysis

2.3 硫酸銨分級(jí)沉淀

圖3 硫酸銨分級(jí)沉淀花生蛋白SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE of peanut protein after ammonium sulfate precipitation

通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀，分別取30%、70%、100%硫酸銨沉淀的花生蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖3)，不同種類蛋白的沉淀區(qū)間不盡相同，隨硫酸銨銨飽和度的增加，沉淀中63kD蛋白條帶逐漸清晰，當(dāng)硫酸銨飽和度為100%時(shí)，沉淀中63kD蛋白含量最高，同時(shí)其他雜蛋白條帶也隨之減少。

2.4 Superdex 200凝膠過(guò)濾層析柱純化過(guò)敏原

通過(guò)100%硫酸銨沉淀的花生蛋白，經(jīng)Superdex 200凝膠過(guò)濾層析，結(jié)果見(jiàn)圖4。一共得到了5個(gè)峰，收集各峰后做SDS-PAGE檢測(cè)。由圖5可見(jiàn)，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示第1號(hào)峰的蛋白主要有1條帶，分子質(zhì)量為63kD，與Arah1蛋白分子質(zhì)量大小相符，另外也有少量的雜蛋白條帶；其余各峰均未出現(xiàn)63kD蛋白條帶。收集第1號(hào)峰的蛋白，經(jīng)Superdex 75凝膠過(guò)濾層析，結(jié)果見(jiàn)圖6，得到1個(gè)峰，收集后做SDS-PAGE檢測(cè)，圖7結(jié)果顯示，第1號(hào)峰的蛋白只有1條帶。由電泳圖像分析軟件得到相關(guān)數(shù)據(jù)，以相對(duì)遷移率為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出的電泳條帶對(duì)應(yīng)分子質(zhì)量為63kD，與已報(bào)道Arah1蛋白分子質(zhì)量大小相符。同時(shí)經(jīng)過(guò)密度掃描可知其純度大于90%。

圖4 Superdex 200凝膠過(guò)濾層析純化峰型圖Fig.4 Purification of protein by Superdex 200 size exclusion chromatography

圖5 Superdex 200凝膠過(guò)濾層析各峰液的SDS-PAGE結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE of purified peanut protein by Superdex 200 size exclusion chromatography

圖6 Superdex 75凝膠過(guò)濾層析純化峰型圖Fig.6 Purification of total protein by Superdex 75 size exclusion chromatography

圖7 Superdex 75凝膠過(guò)濾層析各峰液的SDS-PAGE結(jié)果Fig.7 SDS-PAGE of purified peanut protein by Superdex 75 size exclusion chromatography

2.5 純化后免疫鑒定

取經(jīng)Superdex 75凝膠層析后第1號(hào)峰液進(jìn)行免疫印跡鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖8。第1號(hào)峰有1條陽(yáng)性條帶，分子質(zhì)量為63kD，與預(yù)期的結(jié)果相符，通過(guò)免疫印跡證明純化后蛋白具有免疫活性，且能分離出63kD的花生Ara h1蛋白。

圖8 花生蛋白純化后的蛋白免疫印跡圖Fig.8 Western-Blotting analysis of purified peanut protein

3 討 論

花生過(guò)敏同其他食物過(guò)敏一樣屬于速發(fā)型過(guò)敏，但是與其他食物過(guò)敏的不同處在于大部分花生過(guò)敏病人的這種疾患是終身的[6]?；ㄉ^(guò)敏有時(shí)可引起過(guò)敏性休克[7]，甚至危及生命[8-11]。作為在歐美能夠引起食物過(guò)敏死亡率最高的花生在我國(guó)也應(yīng)該引起高度重視。開(kāi)展花生過(guò)敏研究，分離獲得其主要過(guò)敏原作為研究材料是關(guān)鍵。

本研究利用蛋白質(zhì)在分子質(zhì)量上的差異性通過(guò)凝膠過(guò)濾的方法純化花生過(guò)敏原。凝膠過(guò)濾又叫分子篩過(guò)濾，是利用凝膠粒子為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的差異進(jìn)行分離的液相層析法，它根據(jù)溶質(zhì)顆粒的大小而決定溶質(zhì)流程的長(zhǎng)短，將不同大小分子質(zhì)量的溶質(zhì)分開(kāi)，其原理是凝膠具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分子大小不同的物質(zhì)在層析柱中受固定相的阻滯作用不同，大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部小孔，只能沿凝膠顆粒間的孔隙隨洗脫液流動(dòng)，故受到的阻滯作用小、流程短而較先流出柱外；而小分子物質(zhì)可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，受到的阻滯作用大、流程長(zhǎng)而較后流出層析柱，這樣就使得樣品中分子質(zhì)量大小不同的物質(zhì)得到分離[12-13]。Ara h 1占花生總蛋白的12%，是分子質(zhì)量為63.5kD的糖蛋白[14]，等電點(diǎn)為4.55[15]，熱穩(wěn)定性強(qiáng)、耐酶解、不易消化[16]，同時(shí)通過(guò)對(duì)Ara hl的一級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)的研究表明Ara hl是作為一種三聚體復(fù)合物形式出現(xiàn)的[17]，是比較大的蛋白質(zhì)，所以通過(guò)凝膠過(guò)濾層析的方法進(jìn)行純化分離是可行的，從凝膠過(guò)濾層析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，Ara h1蛋白做為第1個(gè)峰層析出來(lái)，可能是其作為一個(gè)三聚體復(fù)合物大分子的原因。本實(shí)驗(yàn)先用分辨率較低的Superdex200凝膠過(guò)濾柱層析后再用分辨率比較高的Superdex 75凝膠過(guò)濾柱層析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好，基本能得到完全純化的蛋白。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)Ara h1蛋白進(jìn)行鑒定時(shí)，通過(guò)SDSPAGE電泳結(jié)合Western-blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，純化得到的蛋白分子質(zhì)量為63kD左右，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，可以確定純化蛋白即為Ara h1。如需進(jìn)一步研究其生化特性，可對(duì)分離蛋白做等電聚焦及質(zhì)譜分析等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步完善。

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Purification of Peanut Allergen Ara h1

WU Xu-li1,2，XIAO Jie2，LIU Zhi-gang2,*，Zhi-ping3，LIU Jun-jie2
(1. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510642, China；2. Allergy and Immunology Institute, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China；3. Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518060, China)

In order to obtain the peanut allergen Ara h1, ammonium sulfate precipitation and size exclusion chromatography were used for the purification. The identification of peanut allergens was carried out using SDS-PAGE and Western blot analysis.The results indicated that peanut allergen Ara h1 was isolated with purity of more than 90%.

peanut；Ara h1；protein；purification；allergy

TS201.6；R392.8

A

1002-6630(2011)05-0012-04

2010-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30871752)；廣東省科技重點(diǎn)專項(xiàng)(2003A3080502)

吳序櫟(1977—)，男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c食品過(guò)敏。E-mail：wxl@szu.edu.cn

*通信作者：劉志剛(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檫^(guò)敏反應(yīng)。E-mail：lzg@szu.edu.cn