蜂膠和鐵補充對運動大鼠血液鐵狀態(tài)的影響及蜂膠的抗氧化保護作用

車力龍，劉 軍，劉顯東，沈敏杰，顧曉明，解 洋，許化溪，肖德生

(1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

蜂膠和鐵補充對運動大鼠血液鐵狀態(tài)的影響及蜂膠的抗氧化保護作用

車力龍1，劉 軍2，劉顯東2，沈敏杰2，顧曉明2，解 洋2，許化溪1，肖德生1

(1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

目的：觀察蜂膠和鐵補充對運動大鼠血液鐵狀態(tài)指標和血漿自由基代謝的影響，研究蜂膠對運動和/或鐵補充過程中產(chǎn)生的氧化損傷的抗氧化保護作用。方法：40只3月齡Sprague-Dawley雄性大鼠，被隨機分為5組：對照組(C組)、運動組(E組)、運動補鐵組(EI組)、運動補蜂膠組(EP組)和運動補鐵同時補蜂膠組(EIP組)，每組8只。6周遞增負荷跑臺訓(xùn)練后檢測各組大鼠紅細胞指標(紅細胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)、紅細胞比容(Hct))和血漿鐵狀態(tài)指標(血漿鐵(PI)和總鐵結(jié)合力(TIBC))；并檢測血漿MDA和SOD值。結(jié)果：E組紅細胞和鐵狀態(tài)指標顯著低于C組，MDA值顯著高于C組，SOD值顯著低于C組。與E組比較，EI組、EP組和EIP組的紅細胞、鐵狀態(tài)指標均顯著升高；EI組MDA值顯著高于E組，SOD值顯著低于E組；EP組和EIP組MDA值顯著低于E組，SOD值顯著高于E組。EIP組MDA值顯著低于EI組，SOD值顯著高于EI組，但與EP組無顯著差異。結(jié)論：雖然鐵補充能改善運動大鼠貧血和低鐵狀態(tài)，但增加了大鼠氧化應(yīng)激風(fēng)險。蜂膠能有效提高機體清除自由基能力，減少脂質(zhì)過氧化，增強抗氧化酶活性；對改善運動大鼠貧血和低鐵狀態(tài)也有一定作用。

蜂膠；鐵補充；運動大鼠；鐵狀態(tài)；抗氧化

鐵是人體必需的微量元素之一，是構(gòu)成血紅蛋白、肌紅蛋白、細胞色素和與呼吸鏈能量代謝相關(guān)的許多酶的重要成分，因此，鐵缺乏或低鐵狀態(tài)影響人體氧運輸、能量代謝、血紅素代謝、細胞信息傳遞和免疫功能，而且由于最大氧攝入和肌細胞的氧化代謝能力降低，從而影響運動人體的運動速度、運動耐力、運動成績或最大操作能力[1-2]。長期高強度大運動量訓(xùn)練運動員缺鐵性貧血發(fā)病率高于普通人群，或者雖然沒有達到貧血程度，但出現(xiàn)運動性低鐵狀態(tài)，影響運動能力和運動耐力[3-4]。因此，運動營養(yǎng)學(xué)界和運動醫(yī)學(xué)界普遍建議給運動員補充鐵來糾正運動貧血或運動性鐵缺乏。但補鐵會增加體內(nèi)自由基產(chǎn)生[5]，加之劇烈運動過程中自由基產(chǎn)生顯著增加[6]，雙重影響效應(yīng)疊加會進一步加重補鐵運動員體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加運動損傷機率，影響運動成績，并嚴重影響運動員身體健康。因此，尋找合適的既具有抗氧化應(yīng)激能力，又不影響甚至促進運動員補鐵效果的運動保健品或運動食品一直是運動界追求的目標。

蜂膠是蜜蜂從植物芽孢和樹干處采集的樹膠，并混入蜜蜂上顎腺分泌物和蜂蠟經(jīng)咀嚼加工而成的一種天然活性物質(zhì)。已有多個研究顯示，食用蜂膠是安全的，無明顯毒副作用，不產(chǎn)生免疫抗原性反應(yīng)[7-8]。臨床醫(yī)學(xué)實踐中長期將蜂膠作為保健食品和藥物配伍成分。蜂膠成分復(fù)雜，含有大量的黃酮類、萜烯類、氨基酸、多種維生素和微量元素，具有很強的增強機體免疫功能，防御機體氧化損傷[9]，調(diào)理胃腸功能，改善胃腸吸收能力，治療消化道潰瘍和治療貧血的作用[10]。也有關(guān)于蜂膠促進小鼠力竭運動后疲勞恢復(fù)的報道[11]。因此，本實驗將蜂膠與補鐵劑單獨或同時飼喂運動大鼠，觀察蜂膠和補鐵劑單獨或聯(lián)合作用對運動大鼠的補鐵效果、自由基代謝的影響及蜂膠在運動補鐵過程中的抗氧化保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂膠：超臨界CO2萃取方法制備的江大蜂膠軟膠囊，內(nèi)容物為金黃色。每顆膠囊含蜂膠500mg。成人(按60kg體質(zhì)量計)推薦劑量為每天兩顆，相當(dāng)于16.7mg/kg。

蜂膠 江大源生態(tài)生物科技有限公司；大鼠顆粒飼料 南京醫(yī)藥生物工程有限公司；血細胞記數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司；氰化高鐵血紅蛋白檢測試劑盒 天津一方科技有限公司；血漿總鐵結(jié)合力試劑盒、MDA試劑盒和SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722分光光度計 上海光學(xué)儀器廠；原子吸收分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；大鼠跑臺 北京碩林苑科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物

清潔級3月齡Sprague-Dawley雄性大鼠，體質(zhì)量200～220g，由江蘇大學(xué)實驗動物中心提供。飼喂專用大鼠全價營養(yǎng)顆粒飼料，普通木屑墊料，帶柵網(wǎng)標準大鼠飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)，5只/籠。室溫(22±1)℃，相對濕度(50±5)%，12h光照時間(6:00—18:00)和12h黑暗時間交替的晝夜光節(jié)律。

1.3.2 動物分組

大鼠適應(yīng)實驗室環(huán)境2d后進行適應(yīng)性訓(xùn)練3d，10、15min/d。訓(xùn)練期間使用聲音、小木棍、110V電刺激大鼠，確保其運動連續(xù)性和運動強度。然后篩選體質(zhì)量相近、健康活潑、能適應(yīng)跑臺訓(xùn)練的大鼠40只作為正式實驗動物，數(shù)字表法將大鼠隨機分成5組：對照組(C組)、跑臺運動組(E組)、跑臺運動補鐵組(EI組)、跑臺運動補蜂膠組(EP組)和跑臺運動補鐵補蜂膠組(EIP組)，每組8只。訓(xùn)練期間E組有一只大鼠腳趾受傷出血被淘汰。

1.3.3 運動模型制作

參考趙杰修等[12]的方法，大鼠進行遞增負荷跑臺訓(xùn)練。動物跑臺坡度為0度，跑臺速度為30m/min，每周訓(xùn)練6d，訓(xùn)練6周。前兩周每天上午訓(xùn)練1次，后4周每天上、下午各訓(xùn)練1次。第1次訓(xùn)練時間為1min，之后每次以2min/次遞增訓(xùn)練時間，最后1次訓(xùn)練時間為119min。訓(xùn)練過程中大鼠出現(xiàn)嚴重力竭癥狀(連續(xù)施加機械刺激大鼠不能繼續(xù)跑動，下臺后后腹部觸地嚴重，成“甲魚狀”)時允許其休息2～5min，直到完成預(yù)定的訓(xùn)練計劃。

1.3.4 鐵劑和蜂膠的處理

參考劉戌年[13]的方法，按照50mg/(kg·d)用量給EI組和EIP組大鼠灌胃生理鹽水配制的FeSO4混懸液。參考人體與動物用藥劑量換算方法，給EP組和EIP組大鼠灌胃色拉油配制的蜂膠混懸液，劑量為100mg/kg。C組和E組大鼠灌胃等量生理鹽水。灌胃時間為上午運動前3h左右。

1.3.5 樣本收集和各項指標測試

最后一次運動結(jié)束24h后，用戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，心臟采血，肝素抗凝。部分血液生理鹽水稀釋，血細胞記數(shù)板法記數(shù)紅細胞數(shù)(RBC)；高鐵氰化鉀法測血紅蛋白值(Hb)；毛細管法測紅細胞比容(Hct)。剩余血液3000r/min離心10min分離血細胞和血漿，原子吸收分光光度法測定血漿鐵(PI)、血漿總鐵結(jié)合力(TIBC)，然后按照下式計算血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵飽和度(TS)。嚴格按照試劑盒說明測定血漿MDA和SOD濃度。

式中：ρ1為血漿鐵的質(zhì)量濃度/(μg/mL)；ρ0為血漿總鐵結(jié)合力的質(zhì)量濃度/(μg/mL)。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件分析實驗數(shù)據(jù)，ANOVA方差分析，LSD法組間比較，P＜0.05為組間差異顯著性標準。所有結(jié)果數(shù)據(jù)均用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂膠和補鐵對運動大鼠血液RBC、Hb和Hct的影響

表1 蜂膠和補鐵對運動大鼠RBC、Hb、Hct的影響Table 1 Effects of propolis and iron supplements on RBC, Hb and Hct of exercise rats

表1顯示，E組大鼠RBC、Hb和Hct值均極顯著低于C組(P＜0.001)，表明采用的運動模型明顯降低了大鼠血液紅細胞和血紅蛋白水平。EI組大鼠的RBC、Hb和Hct值顯著高于E組大鼠(P＜0.01或 P＜0.001或P＜0.05)，EP組大鼠的RBC、Hb和Hct值顯著高于E組大鼠(P＜0.01或P＜0.001或P＜0.05)，EIP組大鼠的RBC、Hb和Hct值顯著高于E組大鼠(P＜0.001或P＜0.001或P＜0.01)，表明無論是單純補充鐵劑或單純補充蜂膠，還是鐵劑和蜂膠聯(lián)合補充，都能明顯改善運動大鼠紅細胞和血紅蛋白狀態(tài)。EI組RBC和Hct值與C組有差異(P＜0.05)，EP組RBC、Hb值與C組有差異(P＜0.05或P＜0.01)，而EIP組RBC、Hb、Hct值與C組均無差異(P＞0.05)，表明蜂膠和鐵劑聯(lián)合補充對于改善運動大鼠貧血狀態(tài)效果最好，基本恢復(fù)到對照組水平。

2.2 蜂膠和補鐵對運動大鼠血漿鐵狀態(tài)指標的影響

表2 蜂膠和補鐵對運動大鼠血漿鐵狀態(tài)指標的影響Table 2 Effects of propolis and iron supplements on iron status in blood plasma of exercise rats

從表2可以看出，E組大鼠PI和TS值均非常顯著低于C組大鼠(P＜0.001)，TIBC值顯著高于C組大鼠，表明遞增負荷運動導(dǎo)致了明顯的運動性低鐵狀態(tài)。EI組大鼠PI和TS值顯著高于E組大鼠(P＜0.01)，比C組大鼠低，但無顯著性差異(P＞0.05)；EP組大鼠TS值顯著高于E組大鼠(P＜0.05)，但PI和TS值均低于C組大鼠(P＜0.05)；表明單純補充蜂膠也能改善大鼠血漿鐵狀態(tài)，但仍低于C組水平。EIP組大鼠PI和TS值顯著高于E組大鼠(P＜0.01)，TIBC值顯著低于E組大鼠(P＜0.05)，EIP組大鼠血漿3項鐵狀態(tài)指標與C組大鼠均無顯著差異(P＞0.05)，表明鐵劑與蜂膠聯(lián)合補充改善運動性低鐵狀態(tài)的效果最好。

2.3 蜂膠和補鐵對運動大鼠血漿MDA和SOD水平的影響

表3 蜂膠和補鐵對運動大鼠血漿MDA和SOD水平的影響Table 3 Effects of propolis and iron supplements on MDA content and SOD activity in blood plasma of exercise rats

表3顯示，E組大鼠血漿MDA水平顯著高于C組(P＜0.001)，而SOD水平顯著低于C組(P＜0.01)，表明遞增負荷運動引起大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加強，抗氧化活性降低，對機體造成了氧化損傷。EI組大鼠MDA水平顯著高于E組大鼠(P＜0.01)，SOD水平顯著低于E組(P＜0.05)，表明補鐵進一步加劇了運動誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。EP組大鼠MDA水平低于E組大鼠(P＜0.05)，SOD水平顯著高于E組大鼠(P＜0.01)；EIP組大鼠MDA水平顯著低于EI組大鼠(P＜0.001)，與C組大鼠無顯著差異(P＞0.05)；EIP組大鼠SOD水平顯著高于EI組(P＜0.001)和E組大鼠(P＜0.05)，比C組大鼠SOD水平稍高，但差異不顯著(P＞0.05)，表明蜂膠補充對運動大鼠和運動補充鐵劑大鼠的氧化應(yīng)激損傷有明顯的修復(fù)功能。

3 討 論

大量研究表明，長期高強度訓(xùn)練人體或?qū)嶒瀯游飼霈F(xiàn)運動性貧血或運動性低鐵狀態(tài)[14]。本實驗大鼠經(jīng)遞增負荷跑臺訓(xùn)練后，血液紅細胞指標和血漿鐵狀態(tài)指標都顯著下降，與文獻報道結(jié)果[15-16]基本相符。鐵對于運動員非常重要，因為高強度運動訓(xùn)練需要運動員體內(nèi)具有高能量代謝速率以滿足大負荷運動需要，而高能量代謝速率與體內(nèi)氧運輸供應(yīng)能力、酶的生物活性和呼吸鏈能量生成速率等密切相關(guān)。鐵是構(gòu)成血紅蛋白、肌紅蛋白及體內(nèi)許多呼吸鏈能量代謝重要酶的輔助因子，高水平的能量代謝離不開鐵的參與。當(dāng)體內(nèi)鐵代謝紊亂時，如長期大運動量訓(xùn)練導(dǎo)致機體鐵缺乏時，會引起體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受限，血紅蛋白攜氧能力降低，能量代謝水平降低，進而影響運動員運動能力和運動耐力，使運動成績下降或得不到提高。

對于運動性貧血或運動性低鐵狀態(tài)形成的機制目前仍不十分清楚，主要有以下幾種假說對此加以解釋[14]：1)劇烈運動破壞紅細胞，引起溶血；2)劇烈運動使機體鐵丟失增加；3)劇烈運動使機體鐵吸收不良；4)劇烈運動引起鐵攝入不足；5)運動引起血漿容量增加，血細胞和血漿鐵被稀釋；6)運動引起鐵在體內(nèi)的重新分布；7)運動誘導(dǎo)一氧化氮生成增加，反向調(diào)節(jié)機體鐵狀態(tài)水平[17]。但沒有一種假說能夠很好的解釋人體和實驗動物表現(xiàn)出來的所有現(xiàn)象?？赡苄枰瑫r考慮采用的運動方式、運動時間、運動強度甚至動物的種類、性別、年齡等。

由于運動性貧血或運動性低鐵狀態(tài)嚴重影響運動成績，在目前機制不明的情況下，雖然運動醫(yī)學(xué)界和運動營養(yǎng)學(xué)界對于運動員是否需要補鐵以及補鐵效果如何存在很大的爭論，但運動員仍然普遍采取補充鐵劑的方式提高運動成績。本實驗結(jié)果顯示，運動大鼠補充鐵劑后，血液紅細胞和鐵狀態(tài)指標均顯著改善，表明補鐵確實有一定作用。但長時間補鐵必然增加體內(nèi)鐵負荷，增加游離鐵(free iron，F(xiàn)I)的產(chǎn)生。FI參與自由基代謝，通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基(·OH)。一般認為·OH是體內(nèi)所有自由基中對組織細胞毒性最強的自由基，不僅可使許多重要酶活性降低或完全失活，而且可通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)直接造成組織損傷，所以體內(nèi)鐵過載與許多慢性疾病，如糖尿病、心血管疾病、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)病機制關(guān)系密切。MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，其含量可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。SOD是體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)中一種重要的抗過氧化酶，是體內(nèi)抗氧化應(yīng)激損傷的重要成分，其作用是催化超氧陰離子生成H2O2，阻斷·OH的生成。本實驗結(jié)果顯示，補鐵后大鼠血漿MDA水平顯著高于E組，而SOD水平顯著低于E組，表明補鐵增大了運動大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度，降低了機體的防御功能。由于高強度訓(xùn)練本身就增大機體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度，降低機體抗氧化能力，因此，運動大鼠補鐵和高強度運動的雙重效應(yīng)可能進一步加重機體氧化應(yīng)激損傷。本實驗結(jié)果也顯示，EI組大鼠MDA水平不僅高于E組大鼠，而且比C組大鼠更高；而SOD水平也是EI組低于C組程度，大于低于E組程度。說明補鐵和高強度運動對機體氧化應(yīng)激損傷有疊加效應(yīng)。

蜂膠的抗氧化作用已基本得到公認。有學(xué)者認為[18]，蜂膠的抗氧化機制可能是：蜂膠中的黃酮類物質(zhì)可以提高機體抗氧化酶的活性，阻止自由基反應(yīng)的引發(fā)；蜂膠中的黃酮類物質(zhì)可以阻斷自由基鏈式反應(yīng)；蜂膠中還含有抗氧化物質(zhì)如果糖、氨基酸、VE、VC和Se等；蜂膠通過螯合金屬離子如游離鐵離子而削弱金屬離子的促氧化作用。本實驗顯示，大鼠服用蜂膠后，不僅EP組大鼠MDA水平顯著低于E組大鼠，SOD水平顯著高于E組大鼠；而且EIP組大鼠的MDA水平顯著低于EI組大鼠，SOD水平顯著高于EI組大鼠，表明補充蜂膠削弱了運動或/和補鐵引起的氧化損傷，增強了機體抗氧化能力。有意思的是，本實驗顯示補充蜂膠不僅增強了機體的抗氧化能力，而且對改善運動大鼠血細胞降低和血液鐵狀態(tài)也有作用，與Haro等[19]的研究結(jié)果相似。本實驗認為可能與以下幾方面機制有關(guān)：1)蜂膠調(diào)理胃腸道功能，改善腸道血液供應(yīng)，對增加機體鐵吸收能力有一定作用[20]；2)蜂膠能有效治療消化道潰瘍，減少運動引起的鐵丟失；3)蜂膠能提高紅細胞變形能力，降低其脆性，減少劇烈運動過程中紅細胞的破裂[18,21]；4)蜂膠成分非常復(fù)雜，其中含有的氨基酸、果糖、VC和類黃酮都有利于鐵的吸收[19,22]；5)蜂膠能增強機體免疫功能，加速劇烈運動后疲勞的恢復(fù)，提高機體整體代謝水平，也有利于機體對鐵的攝取[23]。但具體機制還有待今后的進一步研究。

綜上所述，補鐵對運動性貧血或運動性低鐵有改善作用，但可能增加機體的氧化應(yīng)激損傷。蜂膠能有效降低運動補鐵造成的氧化應(yīng)激，并對改善運動性貧血或運動性低鐵狀態(tài)有一定作用。

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Effect of Propolis and Iron Supplements on Iron Status in Blood of Exercise Rats and Antioxidant Function of Propolis

CHE Li-long1，LIU Jun2，LIU Xian-dong2，SHEN Min-jie2，GU Xiao-ming2，XIE Yang2，XU Hua-xi1，XIAO De-sheng1
(1. School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. School of Clinical Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212001, China)

Objective: To explore the effects of propolis and iron supplements on iron status and free radical content in blood of exercise rats, and to investigate the antioxidative protection of propolis on oxidative damage derived from exercise and/or iron supplement. Methods: Forty Sprague-Dawley male rats aged 3 months were randomly divided into 5 groups of 8 each: control group (C group), exercise group (E group), exercise plus iron supplement group (EI group), exercise plus propolis supplement group (EP group) and exercise plus supplement with iron and propolis group (EIP group). The rats were subjected to treadmill training with an incremental loading for 6 weeks. Red blood cell indices including red blood cell count (RBC) and hemoglobin (Hb)and hematocrit (Hct), plasma iron status including plasma iron (PI) and total iron binding capacity, and serum MDA and SOD contents of rats were measured. Results: Compared with C group, a significantly lower level of red blood cell indices, iron status and SOD, and an obvious higher level of MDA were observed in E group. Compared with E group, a significantly higher level of red blood cell indices and iron status was observed in rats from EI, EP and EIP groups; meanwhile, MDA content in rats from EI group was higher than that in E group; SOD content in rats from EI group was lower than that in E group. MDA content of rats in EP and EIP groups was lower than that in E group and SOD content of rats in EP and EIP groups was higher than that in E group. MDA content in rats from EIP group was lower than that in EI group and SOD content in rats from EIP group were higher than that in EI group. No significant difference between EP and EIP groups was also observed. Conclusion: Iron supplement can increase the risk of oxidative stress in spite of improving anemia symptom and lower iron status of exercise rats.Propolis can effectively improve the ability of organism to scavenge free radicals, reduce lipid peroxidation, and enhanceantioxidant function. Therefore, propolis can improve the exercise-induced or iron-deficient anemia.

propolis；iron supplement；exercise rats；iron status；antioxidation

S896.6；TS201.4

A

1002-6630(2011)05-0244-05

2010-06-14

國家自然科學(xué)基金項目(30270639)；江蘇大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(1201390005；1201390009)

車力龍(1963—)，男，副教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：cll8880@163.com