玉米低聚肽的體外抗氧化作用

劉文穎，林 峰，金振濤，陳 亮，易維學(xué)，蔡木易,*

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027；2.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100083)

玉米低聚肽的體外抗氧化作用

劉文穎1，林 峰2，金振濤1，陳 亮1，易維學(xué)1，蔡木易1,*

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027；2.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100083)

在對玉米低聚肽的蛋白質(zhì)含量、氨基酸組成和分子質(zhì)量分布進行分析的基礎(chǔ)上，從DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力以及還原能力4個方面對玉米低聚肽的體外抗氧化活性進行考察。組成分析顯示：總蛋白質(zhì)含量為89.28%，酸溶蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)含量的94.31%；氨基酸組成獨特，富含抗氧化性氨基酸，其中亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸含量較高；相對分子質(zhì)量小于1000的組分高達93.05%，主要分布在132～576范圍內(nèi)。體外抗氧化實驗結(jié)果顯示：玉米低聚肽對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的半抑制濃度(IC50值)分別為：1.9、5.4mg/mL和14.9mg/mL，質(zhì)量濃度為5.0mg/mL時的還原能力與0.02mg/mL的抗壞血酸相當(dāng)，并且抗氧化能力與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)劑量關(guān)系。

玉米；低聚肽；氨基酸組成；分子質(zhì)量分布；抗氧化活性

玉米低聚肽是從天然食品玉米中提取的玉米蛋白經(jīng)過酶解技術(shù)而獲得的小分子肽物質(zhì)。較玉米蛋白而言，不僅易被人體吸收，具有特殊的生理功能[1]，而且大大改善了玉米蛋白水難溶性、利用率低的缺陷。

玉米低聚肽含有高比例的亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸以及支鏈氨基酸和中性氨基酸，很少含有賴氨酸等堿性氨基酸。這種特殊氨基酸組成[2]，使得玉米低聚肽具有多種功能，如降血壓、解酒、降低血清膽固醇等，而這些功能都與其抗氧化性有直接關(guān)系[3]。但是目前研究重點主要是降血壓等活性，而對于玉米低聚肽的抗氧化活性缺乏全面和系統(tǒng)的研究。因此，本實驗在對玉米低聚肽的蛋白質(zhì)含量、氨基酸組成和分子質(zhì)量分布進行分析的基礎(chǔ)上，對玉米低聚肽的體外抗氧化活性進行研究，為其開發(fā)和利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米低聚肽：以玉米為原料，利用雙酶解方法制得的粉狀產(chǎn)品，由北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供。

抗壞血酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、水楊酸鈉(均為分析純) 廣東汕頭市西隴化工有限公司；2,2-二苯基-1-苦味肼基自由基(DPPH)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)(均為色譜純) 美國Sigma公司；鄰苯三酚、三氯乙酸(均為分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；835-50型氨基酸分析儀 日本日立公司；UV22100紫外-可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司；QSY-Ⅱ型凱式定氮儀 北京強盛分析儀器制造中心；LG10-2.4A型高速離心機 北京醫(yī)用離心機廠；GSY-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 北京市醫(yī)療設(shè)備廠；PH211 pH計 Hanna儀器公司；AB104-N電子天平 Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米低聚肽酶解工藝流程

玉米→淀粉酶、糖化酶除淀粉→玉米黃粉→堿性蛋白酶→滅酶→中性蛋白酶→滅酶→離心分離→脫苦脫色→脫鹽→噴霧干燥→玉米低聚肽粉

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定

總蛋白質(zhì)含量測定：采用凱氏定氮法[4]；酸溶蛋白質(zhì)含量測定：采用三氯乙酸法[5]。

1.3.3 氨基酸組成

參照GB/T14965—1994《食物中氨基酸的測定方法》，采用氨基酸自動分析儀進行分析[6]。對色氨酸的檢測采用堿水解法，用5mol/L NaOH溶液水解，其余氨基酸以6mol/L HCl溶液水解測定。

1.3.4 相對分子質(zhì)量分布

采用高效液相凝膠色譜法[7]。用流動相配制樣品溶液1mg/mL，經(jīng)孔徑0.2μm聚四氟乙烯過濾膜過濾后，用高效液相色譜儀進行凝膠過濾，紫外檢測器進行檢測，使用GPC軟件處理色譜數(shù)據(jù)。同時配制1mg/mL肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過膜后進樣，制作相對分子質(zhì)量校正曲線。4種肽標(biāo)準(zhǔn)品為：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(相對分子質(zhì)量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(相對分子質(zhì)量451)、桿菌酶(相對分子質(zhì)量1450)、細胞色素C(相對分子質(zhì)量12500)。色譜條件為：色譜柱：TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm；流動相：乙腈-水-三氟乙酸，體積比為45:55:0.1；流速：0.5mL/min；進樣體積：10μL；檢測波長：220nm；柱溫：30℃。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測定

[8]并有所改動。在具塞試管中加入樣品溶液1.5mL和0.1mmol/L DPPH溶液1.5mL，搖勻后避光反應(yīng)30min，于517nm波長處測定吸光度(AS)，同時測定1.5mL 0.1mmol/L DPPH溶液與1.5mL乙醇混合液的吸光度(AC)，以及1.5mL樣品溶液與1.5mL乙醇混合液的吸光度(AB)。以抗壞血酸為對照。按式(1)計算DPPH自由基的清除率。

1.3.6 羥自由基清除能力測定

采用Smirnoff等[9]的水楊酸鈉方法，并略有改動。反應(yīng)體系為2.3mmmol/L FeSO4溶液1mL，2.3mmmol/L水楊酸鈉-乙醇溶液1mL，樣品溶液0.5mL，最后加入1mL 2.2mmmol/L H2O2溶液啟動反應(yīng)，37℃水浴鍋中反應(yīng)1h后，于510nm波長處測定吸光度。以抗壞血酸為對照。按式(2)計算羥自由基的清除率。

式中：A0為不加樣品的吸光度；Ai為加入樣品的吸光度；Aj為無顯色劑時樣品的本底值。

1.3.7 超氧陰離子自由基清除能力測定

采用鄰苯三酚自氧化法[10]。在具塞試管中加入50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH8.2)4.5mL，蒸餾水4.1mL，25℃水浴中保溫20min后，立即加入樣品溶液0.1mL，以及在25℃預(yù)熱過的3mmol/L鄰苯三酚0.3mL，迅速搖勻后于325nm波長處每隔30s測定吸光度。以抗壞血酸為對照。按式(3)計算超氧陰離子自由基的清除率。

式中：ΔA1/Δt為鄰苯三酚自氧化時的反應(yīng)速率；ΔA2/Δt為加入樣品溶液后鄰苯三酚自氧化時的反應(yīng)速率。

1.3.8 還原能力測定

采用Oyaizu法[11]，并略有改動。反應(yīng)體系為2mL樣品溶液，2mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)和2mL 1g/100mL鐵氰化鉀，50℃水浴中保溫20min后，加入2mL 10g/100mL三氯乙酸。取2mL反應(yīng)液，加入2mL蒸餾水和0.4mL 0.1g/100mL FeCl3溶液，放置10min后，于700nm波長處測定吸光度。以抗壞血酸為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米低聚肽的蛋白質(zhì)含量

分析表明，玉米低聚肽中總蛋白質(zhì)含量為89.28%，酸溶蛋白質(zhì)含量為84.20%，占總蛋白質(zhì)94.31%。表明玉米低聚肽中小分子蛋白質(zhì)含量較高。

2.2 玉米低聚肽的氨基酸組成

表1 玉米低聚肽的氨基酸含量Table 1 Amino acid contents in COP

氨基酸是肽的基本組成成分，其種類和含量對肽的抗氧化活性有很大的影響[12]。由表1可知，玉米低聚肽中含有8種必需氨基酸和兩種半必需氨基酸(組氨酸和精氨酸)，含量分別為30.24%和2.37%，占氨基酸總和的36.28%，具有較高的營養(yǎng)價值。谷氨酸、亮氨酸和丙氨酸含量較高，總含量為46.52%，而賴氨酸與色氨酸含量較低，總含量僅為0.48%。氨基酸組成不平衡，這與文獻報道一致[1-2]。

玉米低聚肽的抗氧化活性與其氨基酸組成特點有一定的相關(guān)性。研究表明，許多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，如組氨酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、色氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸等[13-15]。玉米低聚肽富含抗氧化性氨基酸，其中亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸含量較高。Kong等[16]的研究表明玉米肽具有明顯的自由基淬滅能力和還原能力，這與其富含亮氨酸等具有較強金屬離子螯合能力的氨基酸有關(guān)。

2.3 玉米低聚肽的相對分子質(zhì)量分布

表2 玉米低聚肽的相對分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular weight distribution of COP

實驗所得分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：lgMW＝6.914367－0.203034t，R2＝0.999。由表2可知，玉米低聚肽為小分子肽段混合物，相對分子質(zhì)量小于1000的組分高達93.05%，主要分布在576～132范圍內(nèi)，研究表明，肽的抗氧化活性與相對分子質(zhì)量大小有關(guān)，活性較強抗氧化肽相對分子質(zhì)量均較小，氨基酸殘基的數(shù)目一般在20個以內(nèi)[17]。因此，玉米低聚肽是一種具有潛力的抗氧化性物質(zhì)。

2.4 玉米低聚肽對DPPH自由基清除能力

DPPH法是評價抗氧化劑清除自由基能力的常用方法，能比較全面地評價抗氧化活性[18-19]。由圖1可知，在質(zhì)量濃度為0～25mg/mL范圍內(nèi)，玉米低聚肽對DPPH自由基清除率與質(zhì)量濃度呈明顯的劑量關(guān)系，質(zhì)量濃度為5mg/mL時，清除率為92.06%，隨后清除率幾乎保持不變，半抑制濃度(IC50值)為1.9mg/mL?？箟难嵩跇O低質(zhì)量濃度時就表現(xiàn)出很高的清除率，IC50值為4.2μg/mL，可見同等質(zhì)量濃度條件下，抗壞血酸清除DPPH自由基的能力約是玉米低聚肽的452倍。但是與相關(guān)報道的玉米肽相比，如李丹等[12]考察的玉米低聚肽對DPPH自由基的IC50值為29.48mg/mL，可見玉米低聚肽的抗氧化能力還是比較高的。

圖1 玉米低聚肽及抗壞血酸對DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of COP and VC on DPPH free radicals

2.5 玉米低聚肽對羥自由基清除能力

圖2 玉米低聚肽及抗壞血酸對羥自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of COP and VC on hydroxyl free radicals

羥自由基(·OH)是對人體毒性最大的自由基，常作為判斷待測物是否具有抗氧化性的指標(biāo)。由圖2可知，玉米低聚肽具有明顯的清除·OH能力，清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增強，呈明顯的量效關(guān)系，IC50值為5.4mg/mL?？箟难岬腎C50值為0.62mg/mL，同等質(zhì)量濃度下，其·OH清除率約是玉米低聚肽的8.7倍。玉米低聚肽的清除自由基能力與其可作為供氫體使自由基還原，從而終止自由基連鎖反應(yīng)有關(guān)[16]。

2.6 玉米低聚肽對超氧陰離子自由基清除能力

圖3 玉米低聚肽及抗壞血酸對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of COP on superoxide anion free radicals

超氧陰離子自由基(O2·)是多種自由基的衍生源，是評價物質(zhì)抗氧化能力的一個重要指標(biāo)。由圖3可見，玉米低聚肽對O2·的清除能力與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)很好的量效關(guān)系，IC50值為14.9mg/mL，抗壞血酸的IC50值為0.032mg/mL，可見，玉米低聚肽在清除O2·方面比抗壞血酸要弱得多，同時與前兩種自由基清除率相比，也要弱一些。Rajapakse等[20]的研究表明，肽類在清除O2·方面要比清除·OH能力差一些，本實驗結(jié)果也體現(xiàn)了這一點。這是因為·OH較O2·的氧化能力要強得多，能將所有的有機質(zhì)氧化，從而玉米低聚肽與·OH作用能夠顯示出更強的抗氧化能力。

2.7 玉米低聚肽的還原能力

還原能力是抗氧化活力的一個重要指標(biāo)，吸光度越大表明還原力越大，抗氧化能力就越強[17]。由圖4可見，玉米低聚肽和抗壞血酸的吸光度均隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，并且吸光度與質(zhì)量濃度基本成正比關(guān)系，擬合方程為y = 0.044x + 0.1052，R2= 0.9991，可知玉米低聚肽的還原能力與其質(zhì)量濃度成正比，相關(guān)研究中也表明了這一點[17,21]。由計算可知，玉米低聚肽在質(zhì)量濃度為5.0mg/mL時的還原能力與0.02mg/mL的抗壞血酸相當(dāng)。

圖4 玉米低聚肽及抗壞血酸的還原能力Fig.4 Reducing power of COP

與陽性對照抗壞血酸相比，玉米低聚肽的抗氧化能力相對較低，可能由于其成分較為復(fù)雜且為初級提純的工業(yè)化產(chǎn)品，因而會影響其抗氧化的能力。在評價玉米低聚肽抗氧化能力的4個指標(biāo)中，以其清除DPPH自由基能力為最強，考慮到DPPH法的全面、快速和可行性，可以此作為評價玉米低聚肽抗氧化活性的指標(biāo)。

玉米低聚肽的抗氧化能力與其可作為金屬螯合劑、供氫體和自由基穩(wěn)定劑參與反應(yīng)有關(guān)，因此具有較好的自由基清除能力和還原能力。此外其抗氧化能力與玉米蛋白相比要高得多，可能是玉米蛋白高度致密的結(jié)構(gòu)不利于與自由基產(chǎn)生作用，通過酶解后釋放出具有抗氧化活性的小分子肽和游離氨基酸，使參加反應(yīng)的氨基酸側(cè)鏈基團暴露，從而自由基清除能力大大提高[12,16]。

3 結(jié) 論

玉米低聚肽具有較強的DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力，并且具有一定的還原能力，是一種有效的抗氧化肽。通過對其組成分析，表明玉米低聚肽是小分子肽段混合物，氨基酸組成獨特，小分子蛋白質(zhì)含量很高。許多研究表明，肽的抗氧化性與氨基酸種類和含量以及小肽含量有關(guān)，可見，玉米低聚肽的高效抗氧化活性與其抗氧化性氨基酸、小肽和小分子蛋白質(zhì)含量高有一定相關(guān)性。

近年來，功能性低聚肽成為科學(xué)研究的一個嶄新領(lǐng)域。通過對玉米低聚肽抗氧化活性的研究，為其開發(fā)利用提供了實驗依據(jù)。目前對于玉米低聚肽發(fā)揮抗氧化活性的機理和具體功效成分尚不明確，有待深入研究。

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Antioxidant Effect of Corn Oligopeptides in vitro

LIU Wen-ying1，LIN Feng2，JIN Zhen-tao1，CHEN Liang1，YI Wei-xue1，CAI Mu-yi1,*(1. China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100027, China；2. School of Public Health, Peking University, Beijing 100083, China)

On the basis of protein content, amino acid composition and molecular weight distribution of corn oligopeptides(COP), the antioxidant activity of COP in vitro was evaluated by determining the abilities to scavenge DPPH, hydroxyl and superoxide anion free radicals as well as reducing power. Results indicated that the content of total protein was 89.28%, of which acid soluble proteins accounted for 94.31%; amino acid composition was unique and COP was rich in amino acids such as leucine, proline and alanine with strong antioxidant activity. The major molecular weight of COP was less than 1000 (93.05%),and small peptides with a molecular weight range of 132－576 were dominant. The median inhibitory concentrations (IC50 values) of COP for scavenging DPPH, hydroxyl and superoxide anion free radicals on the basis of scavenging rate were 1.9,5.4 mg/mL and 14.9 mg/mL, respectively. The reducing power of COP at a concentration of 5.0 mg/mL was similar to that of ascorbic acid at 0.02 mg/mL. The antioxidant activity of COP exhibited a dose-dependent relationship.

corn；oligopeptide；molecular weight distribution；amino acid composition；antioxidant activity

TS213.4；TQ936.16

A

1002-6630(2011)05-0022-05

2010-06-10

國家“863”計劃項目(2007AA10Z327)

劉文穎(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食源性低聚肽。E-mail：wenyingliu888@126.com

*通信作者：蔡木易(1962—)，男，教授級高工，本科，研究方向為功能食品生物技術(shù)。E-mail：caimuyi@vip.sina.com