全仁夫, 湯樣華, 楊迪生, 黃忠名, 李 偉, 徐金渭, 吳曉春

(1 蕭山中醫(yī)院骨科，浙江 蕭山 311200； 2浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，浙江 杭州 310009； 3上海大學(xué)材料學(xué)院, 上海 200072)

·短篇論著·

HA/ZrO2復(fù)合材料顆粒的體外基因毒性的初步研究*

全仁夫1△, 湯樣華1, 楊迪生2, 黃忠名1, 李 偉1, 徐金渭1, 吳曉春3

(1蕭山中醫(yī)院骨科，浙江 蕭山 311200；2浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，浙江 杭州 310009；3上海大學(xué)材料學(xué)院, 上海 200072)

目的采用體外微核法評(píng)價(jià)HA/ZrO2復(fù)合材料顆粒的基因毒性。方法按不同比例將羥基磷灰石與二氧化鋯粉體混合在高溫高壓下燒結(jié)制備HA/ZrO2復(fù)合材料顆粒，純HA和純ZrO2顆粒作為對(duì)照。制備復(fù)合材料顆粒的懸液，分離和培養(yǎng)兔間充質(zhì)干細(xì)胞。MTT法檢測(cè)復(fù)合材料顆粒懸液對(duì)兔間充質(zhì)干細(xì)胞增殖促進(jìn)作用，體外微核試驗(yàn)(MNT) 檢測(cè)復(fù)合材料顆粒懸液對(duì)兔間充質(zhì)干細(xì)胞的基因毒性。結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)顯示：純HA和含HA的復(fù)合材料顆粒均對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖有一定促進(jìn)作用，而純ZrO2顆粒對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖沒(méi)有促進(jìn)作用，差異顯著(P<0.05)。MNT實(shí)驗(yàn)顯示：HA組與陰性對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，與陽(yáng)性對(duì)照組比差異顯著(P<0.05)； ZrO2組與陰性對(duì)照組比差異顯著(P<0.01)，與陽(yáng)性對(duì)照組比差異不顯著(P>0.05)。結(jié)論HA/ZrO2復(fù)合材料顆粒的基因毒性隨著ZrO2比例和復(fù)合材料濃度的增加而增加，30%wtHA/70%wtZrO2在200 mg/L時(shí)具有顯著基因毒性(P<0.01)。

鋯; 羥基磷灰石類; 復(fù)合材料; 基因毒性

生物材料屬于永久性的植入材料,必須具有良好的生物相容性。任何一種新型生物材料在臨床使用前,都必須進(jìn)行生物相容性檢測(cè),包括組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、基因及分子學(xué)等不同水平的生物學(xué)評(píng)價(jià)。其中,基因毒性主要包括基因突變、染色體異?；蚧蚪M的改變,其檢測(cè)可通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行,其中體外實(shí)驗(yàn)由于操作方便及代表性強(qiáng)而多用作初步篩選實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞水平的基因毒性主要表現(xiàn)為染色體量及結(jié)構(gòu)的異常,體外微核法(micronucleus testinvitro,MNT)是最常用于檢測(cè)染色體異常的實(shí)驗(yàn)方法。本研究按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GBPT16886 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)[1]的要求,擬通過(guò)體外微核法對(duì)新型生物復(fù)合材料-HA/ZrO2梯度復(fù)合材料的體外基因毒性進(jìn)行初步評(píng)價(jià),為其應(yīng)用于臨床的可行性做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

材 料 和 方 法

1材料

1.1HA/ZrO2復(fù)合材料顆粒的制備 由上海大學(xué)高分子材料研究所制備。(1) 納米羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)粉體的制備：將Ca(NO3)2溶解在95%的乙醇中，制成0.5 mol/L的溶液，(NH4)2HPO4溶解于去離子水中，制成0.5 mol/L的溶液；用氨水調(diào)節(jié)2種溶液的pH值為10，各加入5滴乙醇胺；在劇烈攪拌下，先將少量的(NH4)2HPO4加入到Ca2+溶液中，使溶液中產(chǎn)生HA晶核，然后將(NH4)2HPO4溶液全部倒入Ca2+溶液中；反應(yīng)溫度為25 ℃，控制pH值為10，攪拌一段時(shí)間，陳化12 h；然后用99.7%乙醇洗滌3次，用微波爐快速干燥，最后在700 ℃焙燒1 h，得到HA粉體。(2)納米ZrO2粉體的制備：配制含給定Y3+/Zr4+比率的氯化釔(Y2O3+HCl)和氯氧化鋯的混合溶液(上海化學(xué)試劑廠)，HCl濃度控制在0.2 mol/L，鋯鹽濃度選取1.0 mol/L。將混合溶液徐徐加入氨水中，并不斷攪拌，保持體系pH值9-10，靜止沉淀后得到共沉淀物。將共沉淀物過(guò)濾，用蒸餾水洗滌，去除氯離子(<10 mg/L)；再用99.7%乙醇洗滌至少6次，去除H2O(使水含量小于4 vol%)。干燥后得到疏松的氫氧化物前驅(qū)劑。經(jīng)750 ℃煅燒2 h后，得到3.0 mol/LY2O3穩(wěn)定的ZrO2(Y2O3)超細(xì)粉末。(3)HA/ZrO2復(fù)合材料粉體的制備：按照不同比例將納米HA粉體與納米ZrO2粉體配備而成(具體配方設(shè)計(jì)見(jiàn)表1)，將混合顆粒放入剛玉坩鍋中，置于立式硅鉬棒爐內(nèi)常壓下燒結(jié)，加熱至1 600 ℃保溫3 h，隨后燒結(jié)體在爐內(nèi)隨爐冷卻到室溫后取出。

表1不同比例復(fù)合材料粉體的配方設(shè)計(jì)

Table 1. The recipe formulation of the different proportions of the composite particles

RecipeZrO2(%wt)HA(%wt)1010023070350504703051000

1.2復(fù)合材料顆粒懸液的制備 復(fù)合材料顆粒經(jīng)高溫高壓消毒滅菌,DMEM培養(yǎng)基經(jīng)濾過(guò)除菌,將材料粉、液振蕩混勻后在細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中37 ℃放置7 d，離心后取出上清液，再進(jìn)行梯度稀釋，濾過(guò)除菌后備用。

2主要試劑

淋巴細(xì)胞分層液(上海生化試劑廠)，RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)，胎牛血清DMEM培養(yǎng)液(杭州四季青生物公司)，MTT試劑盒(碧云天公司)，Giemsa染液(上海生化試劑公司)，絲裂霉素(Sigma)。

3間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

新西蘭兔經(jīng)3%戊巴比妥鈉1.5 mL/kg腹腔注射麻醉后，以8%硫化鈉去除脛骨近端被毛。術(shù)野經(jīng)碘伏及75%乙醇消毒后，以骨髓穿刺針從脛骨結(jié)節(jié)外側(cè)穿刺，穿刺針旋轉(zhuǎn)刺入髓腔，接5 mL注射器(注射器內(nèi)預(yù)留肝素鈉2 000 U)，抽取骨髓液3-4 mL。吸出的骨髓液緩慢注入預(yù)先加入4 mL淋巴細(xì)胞分層液的試管內(nèi),密度梯度離心,2 500 r/min離心30 min, 離心后吸取中間的單個(gè)核細(xì)胞層，PBS洗1次，以3×105cells/cm2的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液3 mL(含青霉素鈉1×105U/L，鏈霉素100 mg/L，pH 7.2-7.4)。在5%CO2孵箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)。48 h后棄除未貼壁的細(xì)胞，3-5 d后半量換液。繼續(xù)培養(yǎng)且全量每周換液2次。待細(xì)胞長(zhǎng)滿底面后, 用0.25%胰酶消化5 min,即得到原代間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)懸液, 再以1×104cells/cm2的密度傳代培養(yǎng)。

3.1繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖 從第1 d起，取貼壁細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，每天各取3孔計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)3次，計(jì)算均值，連續(xù)6 d，描繪生長(zhǎng)曲線。觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

3.2流式細(xì)胞術(shù)鑒定 取培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L 胰蛋白酶和1 mmol/L EDTA消化后，加入含1%小牛血清的PBS，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×1010cells/L，分別加入CD45-PE、CD54-PE和CD90-FITC小鼠抗大鼠單克隆抗體，4℃孵育30 min，PBS清洗后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定。

4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT cytotoxicity test)

將第3代間充質(zhì)干細(xì)胞以1×104cells/cm2密度種植于24孔板，將HA/ZrO2復(fù)合材料懸浮于培養(yǎng)液中配制成不同濃度的材料顆粒懸液(0、50、200 mg/L)將0.5 mL不同濃度的材料懸液加入到24孔板中，每種濃度重復(fù)6孔。5 d后以PBS洗去培養(yǎng)液及顆粒，每孔細(xì)胞樣本加入100 μL 20%MTT，37 ℃孵育4 h后，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，用酶聯(lián)檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。

5體外微核實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組, 將MSCs以2×104cells/cm2接種于6孔板，培養(yǎng)至70%-80%覆蓋底面,實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)液中加入不同材料和濃度的材料懸液；陽(yáng)性對(duì)照組在培養(yǎng)液中加入0.5 mg/L的絲裂霉素；陰性對(duì)照組只加入培養(yǎng)液,不加入任何材料或絲裂霉素。 48 h后各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液,消化后2 000 r/min離心10 min獲得細(xì)胞團(tuán)塊，棄上清液，加入預(yù)溫至37 ℃的0.1 mol/L KCl溶液，在溫箱中靜置10 min，向懸液中加新鮮1∶3冰醋酸、甲醇固定液，1/5體積于KCl，吹勻，離心吸除上清液，加新鮮固定液2-3 mL；輕輕吹勻，靜置5 min，再離心后，吸除上清，據(jù)細(xì)胞數(shù)量，添加固定液0.1-0.5 mL滴片，Giemsa染色10 min，水洗、晾干、在顯微鏡下觀察并計(jì)算微核的數(shù)目。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)觀察、生長(zhǎng)曲線及表型鑒定

將用密度梯度法分離的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，鏡下可見(jiàn)大量懸浮的細(xì)胞，接種24 h后便有少量的細(xì)胞貼壁, 多為梭形或成纖維細(xì)胞樣，經(jīng)換液后，非貼壁細(xì)胞逐漸減少，貼壁細(xì)胞逐漸呈克隆樣生長(zhǎng)，約10 d后，細(xì)胞逐漸融合，呈放射樣、爆花樣或漩渦樣。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約需10-15 d。傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定,約3-4 d傳代1次。隨著不斷傳代細(xì)胞可以得到純化?？蓚?0代以上。MSCs以1×104cells/cm2接種時(shí)4 d可長(zhǎng)滿瓶底，傳1代細(xì)胞可擴(kuò)增4倍。增殖倍增時(shí)間約為24 h,見(jiàn)圖1。

Figure 1. Growth curve of the MSCs.

圖1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，MSCs高表達(dá)CD90和CD54，陽(yáng)性率分別為94.8%和95.9%，低表達(dá)CD45，陽(yáng)性率僅為12.7%。

2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示：HA和含有HA的復(fù)合材料顆粒均對(duì)細(xì)胞增殖有一定促進(jìn)作用，而單純ZrO2顆粒對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有促進(jìn)作用，HA組與ZrO2組比差異顯著(P<0.05,n=6)，見(jiàn)圖2。

圖2HA/ZrO2復(fù)合材料顆粒細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

3微核實(shí)驗(yàn)

圖3顯示HA組與陰性對(duì)照組差異不顯著，與陽(yáng)性對(duì)照組差異顯著，提示HA不具有基因毒性；ZrO2組與陰性對(duì)照組比較差異顯著，與陽(yáng)性對(duì)照比較差異不顯著，提示ZrO2具有一定基因毒性。HA/ZrO2復(fù)合材料的基因毒性隨著ZrO2比例和復(fù)合材料濃度的增加而增加，30%HA/70%ZrO2在200 mg/L時(shí)有顯著的基因毒性。

圖3復(fù)合材料顆粒懸液體外微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異比較

討 論

隨著生物材料的不斷涌現(xiàn),對(duì)生物材料的毒理研究也日益受到重視。作為長(zhǎng)期存留于體內(nèi)的生物材料,其生物相容性的好壞將直接影響復(fù)合材料對(duì)周圍組織的修復(fù)反應(yīng)。除了細(xì)胞及組織毒性的研究外,復(fù)合材料的基因毒性也被認(rèn)為是評(píng)價(jià)新型材料的必須步驟[2]。微核實(shí)驗(yàn)是反映染色體損傷的重要實(shí)驗(yàn)方法，已廣泛應(yīng)用于遺傳、食品、藥物、環(huán)境等多領(lǐng)域的遺傳毒性評(píng)估。但國(guó)內(nèi)學(xué)者將其應(yīng)用于生物支架材料基因毒性檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道不多，體外微核法作為檢測(cè)基因毒性用于毒理研究已得到公認(rèn), 微核實(shí)驗(yàn)最大的優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、快速。微核是指位于細(xì)胞漿中獨(dú)立于主核的核小體，主要由外界損傷因素作用細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞染色體丟失或斷裂，從而在胞漿中形成1個(gè)或數(shù)個(gè)小核，可選用的細(xì)胞系很廣泛，如人淋巴細(xì)胞、大小鼠外周血和骨髓紅細(xì)胞、生殖細(xì)胞、口腔黏膜細(xì)胞、肝細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞、植物(包括紫露草和蠶豆)細(xì)胞等。故體外微核法已成為新型生物支架材料臨床應(yīng)用前生物相容性研究中不可缺少的一部分。大量研究表明，體外微核法對(duì)于檢測(cè)新材料的基因毒性有很好的敏感性和特異性,且簡(jiǎn)單易行、可自動(dòng)化計(jì)數(shù)及重復(fù)性好[3-5]。利用特殊的細(xì)胞系,它可敏感地表現(xiàn)在材料的影響下細(xì)胞所發(fā)生的染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量上的異常變化。MSCs是一類具有分化潛能的細(xì)胞,在特定條件下可以分化為多種組織細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及神經(jīng)星狀細(xì)胞等,且具有極強(qiáng)的自我復(fù)制能力, 是一種重要組織工程種子細(xì)胞[6-9]。當(dāng)其接觸有基因毒性的材料時(shí),其染色體分裂發(fā)生障礙,出現(xiàn)染色體的斷裂或滯后,導(dǎo)致在分裂后期染色體不能正常分配到子代細(xì)胞中,從而表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)中的染色體樣物質(zhì)-微核,通過(guò)微核數(shù)量的多少可判斷出材料的染色體毒性[10]。本實(shí)驗(yàn)采用了材料的顆粒懸液來(lái)評(píng)價(jià)材料的基因毒性,本實(shí)驗(yàn)為了避免其它化學(xué)提取液本身對(duì)MSCs作用的干擾,采用了細(xì)胞培養(yǎng)基作為材料的浸提液。在毒理實(shí)驗(yàn)中,通常需在進(jìn)行基因毒性實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),以確定實(shí)驗(yàn)材料抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度,再選其范圍內(nèi)的濃度作為基因毒性的實(shí)驗(yàn)濃度。在進(jìn)行基因毒性實(shí)驗(yàn)時(shí),我們采用了高濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度參照，體外微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HA組與陰性對(duì)照組差異不顯著, 而陰性對(duì)照組僅為間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，與陽(yáng)性對(duì)照組差異顯著，說(shuō)明HA不具有基因毒性；ZrO2組與陰性對(duì)照組差異顯著,與陽(yáng)性對(duì)照差異不顯著， 說(shuō)明ZrO2具有一定基因毒性。HA/ZrO2復(fù)合材料的基因毒性隨著ZrO2比例和材料濃度的增加而增加。30%HA/70%ZrO2在200 mg/L時(shí)具有顯著基因毒性。HA/ZrO2復(fù)合材料的基因毒性隨著ZrO2比例的增加而增加，這可由材料的成分比例的不同得到解釋。本研究中用于制備生物復(fù)合材料的2種原材料ZrO2和HA均為用于臨床及實(shí)驗(yàn)研究多年的材料，其生物相容性均得到公認(rèn)[11-13]。而且在前期的研究中也已證實(shí)作為兩者復(fù)合物的新型生物復(fù)合材料―HA/ZrO2梯度復(fù)合材料也具有良好的生物相容性和生物活性、無(wú)細(xì)胞毒性等[14]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為該材料應(yīng)用于臨床提供了進(jìn)一步的客觀評(píng)價(jià)分析。

Figure 4. Giemsa dyeing of the micronucleus formed in each experimental group. Arrows indicate the micronuclei,the intracytoplasmic dyed objects. A: amplified figure of the micronucleus. B: negative control; C: positive control; D: pure HA group; E: 70%HA composite group; F: 50%HA composite group; G: 30%HA composite group; H: pure ZrO2group, 200 mg/L.Bar=10 μm.

圖4各實(shí)驗(yàn)組所形成的微核Giemsa染色

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PreliminarystudyofgenotoxicityofHA/ZrO2compositeparticlesinvitro

QUAN Ren-fu1, TANG Yang-hua1, YANG Di-sheng2, HUANG Zhong-ming1, LI Wei1, XU Jin-wei1, WU Xiao-chun3

(1DepartmentofOrthopedics,XiaoshanTCMHospital,Xiaoshan311200,China;2DepartmentofOrthopedics,SecondAffiliatedHospitalofZhejiangUniversity,Hangzhou310009,China;3MaterialCollegeofShanghaiUniversity,Shanghai200072,China.E-mail:quanrenf@263.net)

AIM: To evaluate the genotoxicity of the hydroxyapatite/ZrO2(HA/ZrO2) composite particles by using theinvitromicronucleus test (MNT).METHODSThe HA/ZrO2composite particles prepared by sintering at high temperature and pressure using the powder of HA and ZrO2with different proportions were compared with the pure HA particle and pure ZrO2particle. The suspension of the composite particles was made. The rabbit mesenchymal stem cells were isolated and cultured. The promotive effect of the composite particles on the proliferation of the rabbit mesenchymal stem cells was detected by MTT method. The genotoxicity of the composite particles to the rabbit mesenchymal stem cells was measured by MNT method.RESULTSThe MTT test showed that both of the pure HA particle and the composite particles containing HA promoted the proliferation of rabbit mesenchymal stem cells. However, no promotive effect of the pure ZrO2particle on the proliferation of rabbit mesenchymal stem cells was observed. The MNT test showed no significant difference between HA group and negative control group (P>0.05), and significant difference between HA group and positive control group (P<0.05). The difference between ZrO2group and negative control group was significant (P<0.01), and the difference between ZrO2group and positive control group was insignificant (P>0.05).CONCLUSIONThe increase in genotoxicity of HA/ZrO2composite particle is dependent on the proportion of ZrO2and the concentration of the composite. The 30%wt HA/70%wt ZrO2composite at the concentration of 200 mg/L shows significant genotoxicity.

Zirconium; Hydroxyapatites; Composite materials; Genotoxicity

R318

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.034

1000-4718(2011)01-0175-04

2010-05-09

2010-09-29

浙江省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No.2007A170);杭州市科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.20080333B23)

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