馮覺(jué)平， 林 梅， 袁響林， 王亞萍， 方 靜， 李 敏

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢430034；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢 430030)

5-氟尿嘧啶改變胰島β細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)并抑制胰島素的釋放*

馮覺(jué)平1△， 林 梅1， 袁響林2， 王亞萍1， 方 靜1， 李 敏1

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢430034；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢 430030)

目的探討5-氟尿嘧啶(5-FU)抑制小鼠胰島β細(xì)胞(NIT-1細(xì)胞)胰島素分泌的相關(guān)分子機(jī)制。方法不同劑量的5-FU作用于NIT-1細(xì)胞，放射免疫分析法檢測(cè)細(xì)胞胰島素分泌功能的變化；Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化；RT-PCR及Western blotting 檢測(cè)胰十二指腸同源盒蛋白-1(PDX-1)mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果5.0-40.0 mg/L的5-FU作用24 h后，低濃度葡萄糖(5.6 mmol/L)環(huán)境下，NIT-1細(xì)胞胰島素分泌無(wú)明顯下降(P>0.05)；而高濃度葡萄糖(16.7 mmol/L)刺激下的胰島素分泌量可被5.0-40.0 mg/L 5-FU以劑量依賴性的方式所抑制(P<0.01)。細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05)；透射電鏡可見線粒體結(jié)構(gòu)改變；經(jīng)10.0-40.0 mg/L的5-FU作用24 h后，PDX-1 mRNA及蛋白表達(dá)的水平均有不同程度的下降(P<0.05)。結(jié)論5-FU可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、導(dǎo)致β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變及數(shù)量減少而抑制胰島β細(xì)胞高糖刺激下的胰島素釋放。下調(diào)PDX-1基因表達(dá)可能是5-FU在高糖條件下誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

氟尿嘧啶； NIT-1細(xì)胞； 胰島素分泌； 超微結(jié)構(gòu)； 胰腺十二指腸同源盒蛋白質(zhì)1

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)一直是結(jié)直腸癌化療最主要、最基礎(chǔ)的藥物,是目前研究的熱點(diǎn)[1，2]。其常見的毒副作用如：骨髓抑制、肝腎功能的損害等已被學(xué)者廣泛關(guān)注。然而近年來(lái)新的研究顯示，含5-FU的聯(lián)合化療可使結(jié)直腸癌患者血糖水平增高[3,4]，嚴(yán)重者可因酮癥酸中毒昏迷而死亡[3]。由于5-FU所誘發(fā)的糖尿病(diabetes mellitus, DM)的機(jī)制尚不清楚，因此使得有針對(duì)性的預(yù)防和治療較為困難。多項(xiàng)非腫瘤性DM基礎(chǔ)研究顯示：其β細(xì)胞功能受損與β細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)[5]，而胰十二指腸同源盒蛋白-1 (pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)是胰島素基因最重要的轉(zhuǎn)錄激活因子[6]，它參與了一系列與維持β細(xì)胞特性和功能有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究以NIT-1細(xì)胞株為研究對(duì)象，以探討結(jié)腸癌常用化療藥物5-FU對(duì)NIT-1細(xì)胞胰島素分泌、凋亡及超微結(jié)構(gòu)的影響及其與PDX-1基因表達(dá)的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1試劑

5-FU購(gòu)自天津金耀氨基酸有限公司，四甲基偶氮唑鹽購(gòu)自Sigma；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)粉、瓊脂糖購(gòu)自Gibco；胰島素放射免疫試劑盒購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC &PI ) 購(gòu)自晶美生物；TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購(gòu)自Promega。引物由上海生工生物公司合成。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠胰島細(xì)胞株NIT-1由華中醫(yī)科大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。NIT-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2濃度的孵育箱中傳代培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化，每5-6 d傳代1次，按所需濃度接種。

2.2放射免疫分析法檢測(cè)NIT-1細(xì)胞的胰島素分泌 細(xì)胞以1×105cells/well的濃度接種于96孔板，每孔1 mL的細(xì)胞懸液。置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，吸棄培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組為5-FU(5.0-40.0 mg/L)。對(duì)照組為等體積F12培養(yǎng)液。孵育24 h后，PBS洗滌2次后，一組換用等體積的含低糖(葡萄糖濃度5.6 mmol/L)的平衡鹽溶液(KRBB)，常規(guī)培養(yǎng)1 h，另一組換用等體積的含高糖(葡萄糖濃度16.7 mmol/L)的KRBB緩沖液培養(yǎng)1 h，分別收集培養(yǎng)液于EP管中，凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)待測(cè)胰島素含量。上清液內(nèi)胰島素含量測(cè)定采用放射免疫分析法。重復(fù)3次。

2.3光鏡觀察 收集上述各組不同培養(yǎng)條件的細(xì)胞懸液，于光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、拍照。

2.4Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分別以不同濃度的5-FU(5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L)為實(shí)驗(yàn)組，以等體積F12培養(yǎng)液為對(duì)照組，常規(guī)培養(yǎng)24 h。按照annexin V/PI雙染試劑盒說(shuō)明操作、測(cè)定，重復(fù)3次。

2.5透射電鏡觀察NIT-1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(5×105cells/well)接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后加入5-FU(5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L)，對(duì)照組加等體積F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。0.25%的胰酶消化，PBS漂洗2次，收集各組細(xì)胞以4%多聚甲醛固定。常規(guī)包埋、切片、染色(醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色)，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并攝片。

2.6RT-PCR方法檢測(cè)PDX-1 mRNA表達(dá) 分別收集不同濃度的5-FU(10.0、20.0、40.0 mg/L)作用后的NIT-1細(xì)胞分別提取總RNA，行RT-PCR 反應(yīng)。參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)引物，PDX-1上游引物5’-TGTAGGCAGTACGGGTCCTC-3’，下游引物5’-CCACCCCAGTTTACAAGCTC-3’，擴(kuò)增325 bp。內(nèi)參照β-actin上游引物5’-ATGGATGACGATATCGCT-3’，下游引物5’-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3’,擴(kuò)增569 bp。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶灰度值。PDX-1 mRNA 表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度=PDX-1條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2.7Western blotting檢測(cè)PDX-1蛋白的表達(dá) 分別收集不同濃度的5-FU(10.0、20.0、40.0 mg/L)作用后的NIT-1細(xì)胞，以Bradford法蛋白定量。常規(guī)蛋白變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜。PVDF膜先后置于1∶500稀釋的Ⅰ抗稀釋液中37 ℃孵育1 h、1∶1 000稀釋的Ⅱ抗稀釋液中孵育，PBS-T洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色曝光，得到的蛋白條帶利用灰度法檢測(cè)其相對(duì)蛋白含量，蛋白含量=PDX-1蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

15-FU對(duì)NIT-1細(xì)胞胰島素分泌的影響

如表1所示，在無(wú)5-FU作用的情況下，高葡萄糖刺激下(16.7 mmol/L)較基礎(chǔ)葡萄糖(5.6 mmol/L)刺激后的胰島素分泌量明顯增高(P<0.01)；在基礎(chǔ)葡萄糖(5.6 mmol/L)環(huán)境下，5-FU (5.0-40.0 mg/L)作用24 h后，隨著5-FU濃度增高，胰島素分泌量稍有下降，但差異無(wú)顯著(P>0.05)；在高濃度葡萄糖刺激下，在5.0-20.0 mg/L范圍內(nèi)，隨著5-FU濃度的增高胰島素分泌量明顯下降，呈劑量依賴性(P<0.01)，與對(duì)照組比較，5.0、10.0、20.0和40.0 mg/L 5-FU作用24 h后，胰島素分泌抑制率分別為9.2%、30.4%、50.7%和54.0%。

表1不同濃度5-FU作用下胰島素釋放量測(cè)定

5-FU(mg/L)Insulinsecretion(mIU/L)5.6mmol/Lglucose16.7mmol/LglucoseControl13.81±0.5526.05±1.38**5.013.03±1.0623.66±1.36△△10.013.11±0.8518.12±1.20△△20.012.33±0.9512.83±0.88△△40.012.59±0.8211.97±0.62▲▲

**P<0.01vs5.6 mmol/L glucose control group;△△P<0.01vscontrol group and each group in sequence;▲▲P<0.01vscontrol group 5.0 and 10.0 groups.

2光鏡觀察結(jié)果

對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞輪廓清楚。5.0-20.0 mg/L 5-FU作用24 h后，細(xì)胞回縮變圓、體積縮小、折光性減弱，5-FU為40 mg/L時(shí)細(xì)胞脫落增多,見圖1。

Figure 1. The NIT-1 cellular morphology treated with 5-FU under light microscope (×40). A:control; B:20 mg/L 5-FU; C:40 mg/L 5-FU(24 h).

圖1NIT-1細(xì)胞光鏡圖

35-FU對(duì)NIT-1細(xì)胞凋亡的影響

5.0-40.0 mg/L 5-FU組早期凋亡率均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；40.0 mg/L 5-FU組晚期凋亡明顯高于對(duì)照組及5.0-20.0 mg/L 5-FU組，差異顯著(P<0.01),見表2、圖2。

表2 5-FU對(duì)NIT-1細(xì)胞凋亡的影響

*P<0.05vscontrol group.

4透射電鏡觀察

對(duì)照組β細(xì)胞呈圓形，胞膜完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)分泌顆粒豐富。5-FU組呈不同程度的凋亡征象：細(xì)胞線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；胰島素分泌顆粒減少；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)密度增大；少數(shù)細(xì)胞可見核固縮，染色質(zhì)邊集，胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松并與胞膜融合形成空泡,見圖3。

55-FU對(duì)NIT-1細(xì)胞PDX-1mRNA及蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組PDX-1 mRNA及蛋白灰度比分別為1.456±0.133及0.847±0.092。經(jīng)10.0、20.0、40.0 mg/L 5-FU處理24 h后，PDX-1 mRNA灰度比分別為1.299±0.143、1.119±0.118及0.585± 0.052；PDX-1 蛋白灰度比分別為0.705±0.064、0.513±0.057和0.509±0.062，5-FU處理后mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(P<0.05),見圖4。

Figure 2. Apoptosis analysis using annexin V/PI flow cytometry in NIT-1 cells treated with 5-FU.A: control; B: 10.0 mg/L 5-FU; C: 40.0 mg/L 5-FU.

圖25-FU誘導(dǎo)NIT-1細(xì)胞凋亡

Figure 3. The NIT-1 cellular morphology treated with 5-FU under transmission electron microscope. A: control; B: endocytoplasmic reticulum swell of mitochondria; C: chromatic agglutination adjacent to the nuclear membrane.

圖3NIT-1細(xì)胞透射電鏡圖

圖4NIT-1細(xì)胞PDX-1mRNA及蛋白的表達(dá)

討 論

繼Tayek等[4]發(fā)現(xiàn)在含5-FU方案化療期間非DM結(jié)腸癌患者中部分空腹血糖水平增高后，K?hne 等[3]也報(bào)道，在含5-FU的聯(lián)合方案治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的患者中，部分非DM患者血糖水平增高，同時(shí)2例胰島素依賴型糖尿病患者胰島素需要量增加33%，1例以飲食控制的DM患者死于酮癥酸中毒昏迷。此外，結(jié)直腸癌患者化療中，既往有DM的患者較非DM患者的5-FU重度毒性明顯增加[8]。我們也在臨床研究中觀察到，非DM結(jié)直腸癌患者在以5-FU為基礎(chǔ)的化療期間可繼發(fā)DM[9]。然而截至目前為止，對(duì)于5-FU相關(guān)的DM的機(jī)制我們所知甚少。

本研究中我們用作觀察胰島β細(xì)胞功能的NIT-1細(xì)胞株來(lái)源于NOD小鼠，由SV40和大鼠胰島素基因的啟動(dòng)子經(jīng)轉(zhuǎn)基因方式產(chǎn)生，主要分泌胰島素，對(duì)葡萄糖刺激的反應(yīng)與體外培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞相似[10]。我們的研究顯示，在無(wú)5-FU作用的情況下，高葡萄糖刺激下較基礎(chǔ)葡萄糖刺激后的胰島素分泌量增加1倍左右(P<0.01)，提示高糖可刺激胰島β細(xì)胞胰島素的分泌。而這種在高糖刺激下的胰島素分泌又可被5-FU呈濃度依賴的方式部分抑制(P<0.01)，5.0、10.0、20.0和40.0 mg/L濃度時(shí)5-FU對(duì)胰島素分泌量的抑制率分別為9.2%、30.4%、50.7%和54.0%。但其對(duì)胰島素基礎(chǔ)分泌量下胰島素分泌量卻并無(wú)明顯影響(P>0.05)。由此我們認(rèn)為，臨床上5-FU治療后的葡萄糖耐受不良可能與其引起的胰島素相對(duì)分泌不足有關(guān)。

目前已經(jīng)明了，糖尿病的β細(xì)胞功能受損與β細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)[4]。我們通過(guò)光鏡實(shí)驗(yàn)觀察到隨著5-FU濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，死亡細(xì)胞明顯增多。證實(shí)了5-FU對(duì)β細(xì)胞的直接毒性可導(dǎo)致β細(xì)胞數(shù)量的減少。同時(shí)我們還觀察到在5-FU作用下β細(xì)胞凋亡也明顯增加，并有細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，如線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及染色質(zhì)邊集等。這些典型的細(xì)胞凋亡改變及流式細(xì)胞儀檢查的結(jié)果均提示：5-FU可誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡。因此我們認(rèn)為5-FU對(duì)β細(xì)胞的直接毒性和凋亡可能導(dǎo)致了胰島素分泌相對(duì)不足，這可能是β細(xì)胞功能受損的主要原因。

關(guān)于5-FU能夠在高糖條件下誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍不清楚。目前的研究顯示，β細(xì)胞的發(fā)育和功能維持受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中PDX-1是胰島素基因最重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，同時(shí)也是葡萄糖激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2等與胰島素釋放有關(guān)的一組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在β細(xì)胞的發(fā)生、分化、成熟及再生等過(guò)程中起重要作用[11]。本研究中，在不同濃度的5-FU作用下，PDX-1 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯減少(P<0.05)。因此我們推測(cè)，由于PDX-1基因表達(dá)發(fā)生變化，β細(xì)胞正常功能和完整性也隨之變化，由5-FU所引發(fā)的PDX-1基因表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致了β細(xì)胞凋亡，因此PDX-1基因表達(dá)的減少與β細(xì)胞功能降低具有密切的關(guān)系[12]。

此外，線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中可能也起著一定作用。由于線粒體是細(xì)胞能量代謝的調(diào)控中心，因此線粒體功能異常可減少胰島素分泌且最終導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡[13]。我們?cè)陔婄R中觀察到β細(xì)胞線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等超微結(jié)構(gòu)的變化。因此我們推測(cè)：5-FU可能引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道開放，使線粒體基質(zhì)腫脹、線粒體外膜破裂，釋放出促凋亡蛋白，引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。對(duì)此我們將進(jìn)一步深入研究。

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Inhibitoryeffectof5-fluorouracilonultra-microstructureandinsulinsecretionofpancreaticβcells

FENG Jue-ping1, LIN Mei1, YUAN Xiang-lin2, WANG Ya-ping1, FANG Jing1, LI Min1

(1DepartmentofOncology,PuaiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScience&Technology,Wuhan430034,China;2CenterofOncology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:fengjueping@163.com)

AIM: To investigate the molecular mechanisms of β cell dysfunction induced by 5-fluorouracil (5-FU) in islet β cell line (NIT-1 cells).METHODSThe NIT-1 cells were treated with different concentrations of 5-FU. The content of insulin in the culture medium was determined by radioimmunoassay. Cell apoptosis was observed by flow cytometry with annexin V/PI staining. The ultra-microstructural changes of NIT-1 cells were observed under transmission electron microscope. The expression of pancreatic and duodenal homeobox protein 1(PDX-1) at mRNA and protein levels in NIT-1 cells was examined by RT-PCR and Western blotting, respectively.RESULTSExposed to the low glucose concentration (5.6 mmol/L), insulin secretion in NIT-1 cells was not significantly decreased following a 24 h treatment with 5.0 to 40.0 mg/L 5-FU (P>0.05). On the contrary, the high glucose (16.7 mmol/L)-stimulated insulin secretion in NIT-1 cells was inhibited by 5.0 to 40.0 mg/L of 5-FU in a dose-dependent manner after 24 h of incubation (P<0.01). The apoptosis rate of NIT-1 cells was significantly increased as compared to those in the control levels(P<0.05). The structural changes of mitochondria were the main apoptotic changes under transmission electron microscope. Significant down-regulation of PDX-1 expression at mRNA and protein levels was observed in NIT-1 cells treated with 5-FU at the concentration of 10.0 mg/L to 40.0 mg/L(P<0.05).CONCLUSION5-FU inhibits the insulin secretion in islet β cell induced by high glucose. A relative deficiency in insulin secretion following 5-FU treatment is related to the changes of β cell ultra-microstructure and the reduction of β cell numbers, by which an increase in apoptosis of pancreatic β cells is induced. Down-regulation of PDX-1 expression may play a pivotal role in increasing the apoptosis of pancreatic β cells induced by 5-FU in high-glucose condition.

Fluorouracil; NIT-1 cells; Insulin secretion; Ultra-microstructure; Pancreatic and duodenal homeobox protein 1

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.023

1000-4718(2011)01-0119-05

2010-07-20

2010-10-21

湖北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目( No.2006JX3A26)；武漢市衛(wèi)生局重點(diǎn)資助項(xiàng)目 (No.武衛(wèi)05-294)

△ 通訊作者 Tel: 027-68831656；E-mail：fengjueping@163.com