不同采收時(shí)期莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉中總黃酮含量測(cè)定

劉百萍，馬 驥，張曉靜，張 昊，朱貞貞

(1.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062;

2.教育部藥用植物資源及天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710062)

不同采收時(shí)期莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉中總黃酮含量測(cè)定

劉百萍，馬 驥*，張曉靜，張 昊，朱貞貞

(1.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062;

2.教育部藥用植物資源及天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710062)

目的:優(yōu)化回流萃取、RP－HPLC檢測(cè)莢果蕨中槲皮素、山奈酚含量的方法，比較不同采收時(shí)期莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉中總黃酮含量，得出莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉的最佳采收時(shí)期。方法:色譜條件:色譜柱Shimadzu C18(250×4.6mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇(A)－0.2%磷酸水(B);采用線性梯度洗脫;流速為1.0mL/min;柱溫為30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm;進(jìn)樣量20μL。結(jié)果:槲皮素在0.18～4.5μg(r2=0.9992)，山奈酚在0.17～4.25μg(r2=0.9994)范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。加樣回收率分別為99.6%、99.45%，RSD值為1.90%，0.91%(n=6)。結(jié)論:該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于莢果蕨的質(zhì)量評(píng)價(jià)。9月份采收的莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉中總黃酮含量最高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用于指導(dǎo)合理采收開發(fā)莢果蕨資源。

莢果蕨，總黃酮，不同采收時(shí)期，高效液相色譜法

莢果蕨(Matteuccia struthiopteris(L.)Todaro)俗名廣東菜、黃瓜香、莢果蕨貫眾，是球子蕨科(Onocleaceae)莢果蕨屬的植物。我國(guó)黑龍江、吉林、河北、河南、陜西及西藏等地有廣泛分布，多生長(zhǎng)于山谷林下及河岸濕地，海拔80～3000m間。莢果蕨是著名的山野菜，其幼葉營(yíng)養(yǎng)可口，具有鮮黃瓜的清香，在東北地區(qū)常常作為出口野菜。莢果蕨具有藥用價(jià)值，在秦巴山區(qū)應(yīng)用廣泛，是商品貫眾的一種［1－2］。其根狀莖及葉柄殘基可入藥，有清熱解毒、殺蟲、止血、預(yù)防流感的功效。由于莢果蕨植株形狀優(yōu)美，也可作為室內(nèi)盆栽或用作室外觀賞植物。黃酮類化合物是一類在植物中含量豐富的植物次生代謝產(chǎn)物，楊嵐等人研究報(bào)道，莢果蕨中含有芹菜素、莢果蕨素、去甲氧基莢果蕨素、莢果蕨黃素等黃酮類化合物［3－4］;李娜等研究表明，槲皮素是球子蕨科共有成分［5］;洪葉嵐等的研究表明，莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉中含山奈酚、槲皮素［6］。黃酮類化合物具有抗衰老、抗癌、抑菌、保健等功效。槲皮素有很強(qiáng)的抗氧化作用，可透過(guò)血腦屏障，并對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞有明顯的抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用［7］;山奈酚能抑制與兒童髓母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其受體酪氨酸蛋白激酶［8］，抑制人胃癌細(xì)胞MGC2803的增殖并誘導(dǎo)其凋亡［9］。本文參照洪葉嵐等的方法［6］，對(duì)莢果蕨中槲皮素、山奈酚進(jìn)行了提取及檢測(cè)條件的優(yōu)化，4月到9月是莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉的生長(zhǎng)期，對(duì)不同采收時(shí)期莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉中的槲皮素、山奈酚及總黃酮含量的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，為合理開發(fā)利用莢果蕨提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槲皮素、山柰酚對(duì)照品 中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量純度分別為97.3%、95.9%，批號(hào)分別為110861－200606、100081－200406;樣品 莢果蕨于2009年4月至9月采自陜西省安康市旬陽(yáng)壩林場(chǎng)，經(jīng)陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院肖婭萍教授、馬驥副教授鑒定為莢果蕨，標(biāo)本現(xiàn)存于陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)標(biāo)本室;甲醇 色譜純;水 超純水;其余試劑 均為分析純。

Shimadzu LC－2010高效液相色譜儀 日本島津公司;HH－6B數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 上海亞榮生化儀器廠;KQ－300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;DAD檢測(cè)器，AT2201電子分析天平(d=0.1mg)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Shimadzu C18(250×4.6mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇(A)－0.2%磷酸水(B);采用線性梯度洗脫(0→30m in，甲醇40%→65%，0.2%磷酸水60%→35%);流速為1.0m L/m in;柱溫為30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm;進(jìn)樣量為20μL，見(jiàn)圖1。

圖1 槲皮素、山奈酚對(duì)照品(A)和樣品(B)的HPLC

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對(duì)照品、山奈酚對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配制成槲皮素濃度為0.18mg/m L、山奈酚濃度為0.17mg/m L的對(duì)照品溶液，于4℃冰箱避光保存。

1.2.3 樣品溶液的制備 材料清洗、陰干、粉碎、過(guò)65目篩，精密稱取待測(cè)莢果蕨粉末 1.000g，置于50m L圓底燒瓶中，加30m L 90%乙醇，于80℃恒溫水浴鍋中回流提取1h，取出后加入2m L鹽酸回流酸解1h。取出冷卻至室溫，抽濾，濾液減壓蒸干，用甲醇定容至10m L容量瓶，搖勻，用微孔濾膜(0.22μm)過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.4 提取溶劑和提取方法的優(yōu)化 根據(jù)槲皮素、山奈酚的理化性質(zhì)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［10，12］，選用了不同濃度的甲醇(100%、90%、80%、70%、60%)、乙醇(100%、95%、90%、80%、70%、60%)為提取溶劑，溶劑量分別為 10、15、20、25、30m L，回流時(shí)間 1、1.5、2、2.5、3h以及提取溫度 70、80、90℃進(jìn)行比較提取，結(jié)果顯示，90%乙醇80℃恒溫水浴回流提取2h，槲皮素、山奈酚的提取率高，效果最好。

1.2.5 檢測(cè)條件的優(yōu)化 比較了用甲醇－水、甲醇－0.2%磷酸水、甲醇－0.4%磷酸水作為流動(dòng)相，進(jìn)行等度、梯度洗脫，結(jié)果顯示，用等度洗脫時(shí)2種物質(zhì)的分離效果不好，流動(dòng)相為甲醇(A)－0.2%磷酸水(B);采用線性梯度洗脫(0→30m in，甲醇40%→65%，0.2%磷酸水60%→35%)的分離效果好，峰形好。

1.2.6 總黃酮含量的計(jì)算 總黃酮含量的計(jì)算參照05版藥典中銀杏葉提取物總黃酮甙含量計(jì)算方法［13］計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液 1、5、10、15、20、25μL，在1.2.1的色譜條件下分別進(jìn)樣，記錄其峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得線性回歸方程:Y=581779X+175532(R2=0.9992)，線性范圍:0.18～4.5μg。

精密吸取山奈酚對(duì)照品溶液 1、5、10、15、20、25μL進(jìn)樣，記錄其峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程Y=684356X+157868(R2=0.9994)，線性范圍:0.17～4.25μg。

2.2 精密度考察

取上述對(duì)照品溶液，重復(fù)測(cè)定6次，每次進(jìn)樣20μL。分別測(cè)得槲皮素的峰面積為 14561876、14544310、14779626、14644654、14542950、14852327;山奈酚的峰面積為 25159070、25352290、25680726、25359558、25048931、25443491。計(jì)算槲皮素，山奈酚峰面積的 RSD值，結(jié)果為槲皮素0.91%、山奈酚0.87%(n=6)，精密度良好。

2.3 重復(fù)性考察

取同一份樣品6份，按照1.2.3中方法制備供試品溶液，精密吸取20μL進(jìn)樣，測(cè)定槲皮素、山奈酚峰面積，計(jì)算含量。得槲皮素的含量分別為1.139、1.144、1.122、1.147、1.123、1.135mg/g;山奈酚的含量分別為 2.427、2.513、2.438、2.439、2.507、2.454mg/g。計(jì)算2種成分含量的RSD值分別為0.93%、1.52%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

取同一樣品溶液，按照1.2.3中方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，分別在提取后的0、6、12、18、24、36、48h進(jìn)行檢測(cè)，記錄槲皮素、山奈酚峰面積，得槲皮素的峰面積分別為 754799、732009、756538、743277、732975、721453、740996;山奈酚的峰面積為1997434、1998332、1945093、1924807、1989091、1944003、1931907。計(jì)算其 RSD值，結(jié)果分別為1.71%、1.64%(n=7)，表明該樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取1.000g已知含量的樣品6份，分別加入適量對(duì)照品溶液，按上述供試品的制備方法制成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 莢果蕨中槲皮素的加樣回收率

表2 莢果蕨中山奈酚的加樣回收率

2.6 樣品測(cè)定

按照1.2.3所述方法分別對(duì)9月份采集的莢果蕨樣品的不同部位及不同采收期的莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉樣品進(jìn)行制備，按1.2.1所述色譜條件對(duì)樣品中槲皮素、山奈酚進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3及圖2。

表3 莢果蕨不同部位中槲皮素、山奈酚的測(cè)定結(jié)果(n=3)

圖2 不同采收時(shí)期莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉中槲皮素、山奈酚的測(cè)定結(jié)果

2.7 總黃酮含量

根據(jù)1.2.6中總黃酮甙含量計(jì)算方法，得出不同采收時(shí)期莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉中總黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同采收時(shí)期莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉中總黃酮的含量

3 結(jié)論

在9月份后期采收的莢果蕨營(yíng)養(yǎng)葉中總黃酮含量最高，此時(shí)孢子葉的孢子已生長(zhǎng)成熟，保證了莢果蕨的繁殖能力。莢果蕨是多年生草本植物，根狀莖是其營(yíng)養(yǎng)繁殖的根本保證，采收其營(yíng)養(yǎng)葉提取黃酮類化合物，對(duì)莢果蕨資源的保護(hù)非常有利。本實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化的反相高效液相色譜測(cè)定法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠、準(zhǔn)確，可為莢果蕨中黃酮類化合物的進(jìn)一步研究開發(fā)提供依據(jù)。

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Determination of total flavonoids in Matteuccia struthiopteris(L.)Todaro foliage leaves of different harvest time

LIU Bai－ping，MA Ji*，ZHANG Xiao－jing，ZHANG Hao，ZHU Zhen－zhen

(1.Life Science College，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China;2.Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Plant Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry，Xi’an 710062，China)

Using the methods of reflux extraction and detection of quercetin and kaempferol in Matteuccia struthiopteris(L.)Todaro by RP－HPLC，the content of flavonoid in different harvest periods and evaluated the optimal harvest time were compared.The separation of the targets was performed on Shimadzu C18(250mm×4.6mm，5μm)column with the column temperature at 30℃，by gradient elution using methanol－H2O with 0.2%phosphate acid as the mobile phase at the flow rate of1.0m L/m in，the detective wavelength was set at360nm.The linear range of quercetin was 0.18～4.5μg(r2=0.9992)and kaempferol was 0.17～4.25μg(r2=0.9994)，with average recoveries of 99.6%(RSD 1.90%)，99.45%(RSD 0.91%).The method was simple，accurate and reproducible，can be used for quality control of quercetin and kaempfero in Matteuccia struthiop teris(L.).The contents of flavonoid collected at september was the best.These can guide the reasonable collecting and make the best use of Matteuccia struthiop teris(L.)resource.

Matteuccia struthiop teris(L.)Todaro;flavonoid;different harvest time;HPLC

TS201.1

A

1002－0306(2011)07－0407－03

2010－12－08 *通訊聯(lián)系人

劉百萍(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:藥用植物資源研究。

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃(2006BAI06A12－04)。