板栗殼原花青素提取及其穩(wěn)定性研究

張海暉，李金鳳，段玉清*，馬海樂，徐菲菲，秦 宇

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

板栗殼原花青素提取及其穩(wěn)定性研究

張海暉，李金鳳，段玉清*，馬海樂，徐菲菲，秦 宇

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

為充分利用板栗殼資源，采用響應(yīng)面法優(yōu)化板栗殼原花青素提取工藝，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行探討以獲得最佳貯藏條件。研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間對(duì)原花青素提取得率的影響；考察pH值、光、溫度、部分添加劑和金屬離子對(duì)板栗殼原花青素穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示，板栗殼原花青素最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)51.1%、料液比1:14.5(g/mL)、浸提溫度67.3℃、浸提時(shí)間2h，在此條件下板栗殼原花青素提取得率理論值為40.35mg/g，實(shí)測(cè)值為40.23mg/g。板栗殼原花青素在pH2.2～6條件下穩(wěn)定，對(duì)光不穩(wěn)定，宜避光低溫(4～20℃)保藏；適量的亞硫酸氫鈉對(duì)板栗殼原花青素有一定的保護(hù)作用，苯甲酸鈉對(duì)其穩(wěn)定性有影響；板栗原花青素在Na+、K+、Mg2+和Al3+存在時(shí)較穩(wěn)定，而Ca2+、Fe2+和Cu2+不能與之共存。因此，固態(tài)條件下，要保持板栗殼原花青素穩(wěn)定，需對(duì)溫度、光照、金屬離子加以控制；水溶液中，弱酸性環(huán)境及適量亞硫酸氫鈉有利于改善板栗殼原花青素的穩(wěn)定性。

板栗殼；原花青素；提??；穩(wěn)定性

板栗(Castanea mollissima Blume)作為我國(guó)傳統(tǒng)的農(nóng)副產(chǎn)品，年產(chǎn)量超過100萬(wàn)噸，占世界板栗總產(chǎn)量的3/4，板栗生產(chǎn)和加工過程中近8.9%～13.5%的板栗殼，仍主要以燃燒和自然腐爛方式被廢棄，僅有少數(shù)利用板栗殼制備活性炭、吸附水中重金屬離子和殺蟲劑的報(bào)道[1-7]，因此充分利用廢棄資源創(chuàng)造更多的經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。板栗殼中富含色素已有文獻(xiàn)報(bào)道[8-11]，但未見原花青素類物質(zhì)的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)板栗殼粗提物中富含原花青素(procyanidins，PC)，因原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化活性、改善心血管疾病、抗癌、抗輻射和抗病毒等生物活性[12-13]，使其在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。因此尋找新的富含原花青素的資源和適合于工業(yè)化生產(chǎn)的提取方法是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以板栗殼中原花青素為目標(biāo)成分，采用響應(yīng)面分析方法對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行研究。以期為板栗殼工業(yè)化制備和資源的綜合利用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

板栗為市售，剝殼后，取栗殼洗凈，自然陰干，粉碎過40目篩得板栗殼粉末，冷凍保存，備用。

香草醛、苯甲酸鈉、濃鹽酸、乙醚、無(wú)水乙醇上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

722N分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DK-SD型電熱恒溫水浴鍋 上海金宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取板栗殼原花青素工藝

板栗殼→粉碎→過40目篩→用正己烷于室溫?fù)u床(150r/min)脫脂24h→過濾→殘?jiān)鶕?jù)料液比加入溶劑→提取(控制適當(dāng)條件)→過濾(200目尼龍網(wǎng)篩)→收集上清液→測(cè)定原花青素含量→計(jì)算得率[14-15]。

1.2.2 原花青素含量和提取得率測(cè)定

采用香草醛-濃鹽酸法[16]，以兒茶素為對(duì)照品，得到原花青素質(zhì)量濃度與吸光度曲線的回歸方程：y=12.003c－0.0086，R2=0.9959。

式中：c為提取液中原花青素質(zhì)量濃度/(mg/mL)；v為提取液的體積/mL；m為板栗殼干質(zhì)量/g。

1.2.3 板栗殼原花青素提取的單因素試驗(yàn)

提取溶劑：稱取脫脂板栗殼2.0g，分別加入料液比1:10的不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，60℃浸提2h，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)(30%～80%)對(duì)提取得率的影響。

料液比(g/mL)：稱取脫脂板栗殼2.0g，加入60%乙醇溶液，60℃浸提2h，考察不同料液比(1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)對(duì)原花青素提取效果的影響。

浸提溫度：稱取脫脂板栗殼2.0g，按料液比1:20加入60%乙醇溶液，浸提2h，考察不同浸提溫度(30、40、50、60、70、80℃)對(duì)原花青素提取效果的影響。

浸提時(shí)間：稱取脫脂板栗殼2.0g，按料液比1:20加入60%乙醇溶液，60℃浸提考察不同浸提時(shí)間(0.5、1、2、3h)對(duì)原花青素提取效果的影響。

1.2.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間4個(gè)因素，利用Box-Behnken中心組合原理，選取5個(gè)中心點(diǎn)進(jìn)行29個(gè)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 板栗殼原花青素提取響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental factors and levels in response surface analysis

1.2.5 穩(wěn)定性研究

利用最佳的提取工藝獲得的板栗殼原花青素粗提取物，經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂柱吸附，收集50%乙醇洗脫液，于40℃真空濃縮，冷凍干燥，得純化的板栗殼原花青素(procyanidins from chestnut shell，CSPCs)。考察pH值、光、溫度、不同添加劑及金屬離子對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1A可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%左右時(shí)，提取得率最高。當(dāng)高于此體積分?jǐn)?shù)后醇溶性雜質(zhì)、色素和親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些成分與PC競(jìng)爭(zhēng)乙醇-水分子，使PC溶出率降低，進(jìn)而導(dǎo)致原花青素的提取得率下降。

通常溶劑用量越大提取得率越大。由圖1B可見隨著料液比的增加PC得率增加，而當(dāng)料液比大于1:20時(shí)，PC得率隨料液比的變化不大?？紤]過高的料液比會(huì)增加后序的能耗，增加生產(chǎn)成本，所以選擇料液比為1:15左右為宜。

溫度升高分子運(yùn)動(dòng)速度加快，進(jìn)而滲透和擴(kuò)散速度加快。由圖1C可見隨著溫度的升高，PC得率升高，但溫度過高PC結(jié)構(gòu)易破壞，導(dǎo)致得率降低。故選擇60℃左右是PC提取的最佳溫度。

圖1 不同提取條件對(duì)板栗殼原花青素得率的影響Fig.1 Effect of process conditions on extraction yield of the chestnut shell procyanidins

由圖1D可見，提取時(shí)間在0.5～2h之間時(shí)，PC得率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，大于2h后，PC得率隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低?？赡苁怯捎赑C富含酚羥基可作為H供體，易被空氣中的氧氣所氧化，所以提取時(shí)間不超過2h。

2.2 原花青素提取的響應(yīng)面分析

根據(jù)表2通過Design-Expert 7.1.3統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析，建立響應(yīng)面的回歸模型，進(jìn)而尋求最優(yōu)響應(yīng)值的因素水平，分析結(jié)果見表3和表4。從表4可以看出，剔除不顯著項(xiàng)，回歸方程簡(jiǎn)化為下式：

Y =24.6－5.41X1＋1.57X2＋5.08X3＋8.36X4－1.68X1X3－3.90X1X4＋3.78X3X4－1.81X12－1.11X22－1.99X42

由表3可以看出，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9841，說明回歸方程的擬合度好。模型的調(diào)整確定系數(shù)為0.9682，可以較好解釋模型的變化。通過響應(yīng)面分析試驗(yàn)確定板栗殼原花青素提取的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)51.1%、料液比1:14.5(g/mL)、浸提溫度67.3℃、浸提時(shí)間2h。在此條件下，原花青素得率理論值為40.35mg/g。實(shí)際測(cè)得板栗殼原花青素得率為40.23mg/g。因此，采用RSE法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

表2 板栗殼原花青素提取響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Scheme and experimental results of response surface central composite design

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the developed regression equation for extraction yield of the chestnut shell procyanidins

表4 回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of of variance for each term of the developed regression equation for extraction yield of the chestnut shell procyanidins

2.3 穩(wěn)定性研究

2.3.1 pH值對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影晌

圖2 pH值對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of pH on stability of CSPCs

原花青素富含酚羥基，呈弱酸性[17-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在pH2.2～6條件下，CSPCs室溫下封口放置15d內(nèi)，吸光度變化很小(圖2)，表明在此pH值范圍內(nèi)CSPCs比較穩(wěn)定。

2.3.2 光對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響

圖3 光對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of light on stability of CSPCs

由圖3可見，室溫下封口2d內(nèi)原花青素在自然光、暗光和避光條件均較穩(wěn)定；2d后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)原花青素的穩(wěn)定性下降，但避光條件下基本穩(wěn)定，說明原花青素宜避光保存。

2.3.3 溫度對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響

圖4 溫度對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on stability of CSPCs

由圖4可見，CSPCs在高溫下不穩(wěn)定，當(dāng)溫度在40～90℃范圍內(nèi)時(shí)，CSPCs極不穩(wěn)定，溫度過高CSPCs會(huì)發(fā)生氧化聚合反應(yīng)導(dǎo)致穩(wěn)定性差；4℃和20℃儲(chǔ)存20d后，CSPCs吸光度幾乎無(wú)變化。所以CSPCs應(yīng)在低溫下或20℃以下保存。

2.3.4 苯甲酸鈉對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響

圖5 苯甲酸鈉對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of sodium benzoate on stability of CSPCs

從圖5可以看出，隨著苯甲酸鈉質(zhì)量濃度的增加，CSPCs吸光度明顯增加，這可能是苯甲酸鈉的加入破壞了CSPCs的結(jié)構(gòu)。所以在CSPCs貯藏中盡量不加苯甲酸鈉防腐劑。

2.3.5 亞硫酸氫鈉對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響

圖6 NaHSO3對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of NaHSO3 on stability of CSPCs

由圖6可見，當(dāng)溶液中NaHSO3的質(zhì)量濃度在0～0.5μg/mL時(shí)吸光度略微下降，后來(lái)隨著NaHSO3質(zhì)量濃度的增加，吸光度緩慢增加。整體上NaHSO3對(duì)CSPCs的穩(wěn)定性影響不大，并且一定劑量的NaHSO3對(duì)CSPCs有保護(hù)作用。

2.3.6 金屬離子對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響

由圖7可見，0.1mol/L的不同金屬離子對(duì)CSPCs的穩(wěn)定性有一定的影響。尤其以Ca2+、Fe2+和Cu2+的影響最為顯著；而Na+、K+、Mg2+和Al3+對(duì)CSPCs的影響較小。表明CSPCs不宜與Ca2+、Fe2+和Cu2+共存，即不宜采用鐵和銅器皿貯藏。

圖7 金屬離子對(duì)CSPCs穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of metal ions on stability of CSPCs

3 結(jié) 論

3.1 通過單因素和響應(yīng)面分析得出CSPCs提取的最佳條件為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)51.1%、料液比1:14.5(g/mL)、浸提溫度67.3℃、浸提時(shí)間2h，在此條件下CSPCs提取得率理論值為40.35mg/g，實(shí)測(cè)值為40.23mg/g。

3.2 CSPCs在弱酸性環(huán)境下較穩(wěn)定；對(duì)光熱不穩(wěn)定，宜避光、低溫保藏；適量的亞硫酸氫鈉對(duì)CSPCs有一定的保護(hù)作用，而苯甲酸鈉不能與之共存；在Na+、K+、Mg2+和Al3+存在時(shí)較穩(wěn)定，而Ca2+、Fe2+和Cu2+不能與之共存。

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Extraction and Stability of Procyanidins from Chestnut Shells

ZHANG Hai-hui，LI Jin-feng，DUAN Yu-qing*，MA Hai-le，XU Fei-fei，QIN Yu
(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

To make full use of chestnut shell resources, the optimum extraction process for procyanidins from chestnut shells(CSPCs) with aqueous ethanol was investigated by response surface analysis, and the stability of CSPCs was explored for its best storage conditions. The effects of ethanol concentration, ratio of solid to liquid, extraction temperature and time on the yield of CSPCs were evaluated, and the effects of pH, light, temperature, additives and metal ions on the stability of CSPCs were also investigated. The optimized extraction conditions were as follows: extraction with a 14.5-fold volume of 51% aqueous ethanol solution at 69.3 ℃ for 2 h. Under these conditions, the theoretical yield of CSPCs was 40.35 mg/g, and the measured value was 40.23 mg/g. The results of stability experiments showed that CSPCs was stable at pH 2.2－6, whereas it had poor light stability and should be consequently stored in darkness at low temperature (4 － 20 ℃). NaHSO3 could protect CSPCs to some extent.Na+, K+, Mg2+, and Al3+were found to have positive contribution to CSPCs stability, while sodium benzoate, Ca2+, Fe2+and Cu2+could not coexist with CSPCs. Therefore, to maintain the stability of CSPCs, it is necessary to control temperature, light and metal ions. An acidic environment and the presence of NaHSO3 can improve the stability of CSPCs.

chestnut shell；procyanidins；extraction；stability

Q949.6

A

1002-6630(2011)08-0005-05

2010-07-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30270938)；國(guó)家博士后基金項(xiàng)目(20100471379)；江蘇省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目(05KJB550011)；江蘇大學(xué)人才基金項(xiàng)目(05JDG013；128300289)

張海暉(1975—)，男，副教授，博士，主要從事農(nóng)副產(chǎn)品活性因子提取分離新技術(shù)研究。E-mail：z_haihui@163.com

*通信作者：段玉清(1973—)，女，副教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程研究。E-mail：dyq101@ujs.edu.cn