微波消解-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定禽蛋中卵磷脂含量

葛慶聯(lián)，吳 敏，張小燕，唐夢(mèng)君，蒲俊華，高玉時(shí)，陳寬維*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇 揚(yáng)州 225003)

微波消解-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定禽蛋中卵磷脂含量

葛慶聯(lián)，吳 敏，張小燕，唐夢(mèng)君，蒲俊華，高玉時(shí)，陳寬維*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇 揚(yáng)州 225003)

建立一種快速測(cè)定禽蛋中卵磷脂含量的方法-微波消解分光光度法。禽蛋勻漿液經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇處理，去除其中磷蛋白對(duì)卵磷脂含量的干擾后，再采用微波消解法對(duì)禽蛋樣品進(jìn)行預(yù)處理后，用分光光度法于400nm波長(zhǎng)處測(cè)定卵磷脂含量。方法回收率均在90%以上，變異系數(shù)均低于2%，具有良好的準(zhǔn)確度與精密度。與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有試劑用量少，操作簡(jiǎn)單，減少沾污，改善工作環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，是一種有效、實(shí)用的方法。

可見(jiàn)分光光度法；卵磷脂；禽蛋

卵磷脂是一類具有特定功能含磷的極性類脂合物，是天然的具有營(yíng)養(yǎng)性和功能性的表面活性劑，是人、動(dòng)物和植物組織細(xì)胞膜的組成成分，具有防止動(dòng)脈硬化、改善神經(jīng)組織、提高大腦活力的作用，被譽(yù)為“細(xì)胞的保護(hù)神”和“血管清道夫”。因此測(cè)定禽蛋中的卵磷脂具有實(shí)際意義[1]。

目前，卵磷脂的測(cè)定方法主要有光譜法[2-7]和色譜法[8-14]。其中光譜法包括傳統(tǒng)定磷法、紫外分光光度法和核磁共振光譜分析法。定磷法操作復(fù)雜，容易造成損失，而且耗時(shí)長(zhǎng)，紫外分光光度法所用的波長(zhǎng)短，容易受溶劑的干擾，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，核磁共振光譜法和色譜法的儀器設(shè)備昂貴，維護(hù)費(fèi)用高，不利于廣泛應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合實(shí)際，利用近年興起的微波消解技術(shù)在試樣前處理中快速、分解完全、元素?zé)o揮發(fā)損失、酸耗量少等優(yōu)點(diǎn)[15]對(duì)禽蛋等樣品進(jìn)行前處理，以釩鉬酸銨分光光度法測(cè)定禽蛋中磷的含量，使用系數(shù)25將含磷量換算為卵磷脂質(zhì)量，旨在為禽蛋中軟磷脂測(cè)定方法的建立提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

禽蛋由農(nóng)業(yè)部家禽品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(揚(yáng)州)提供。無(wú)水乙醇(分析純)、濃硝酸(分析純)、雙氧水(分析純)、磷脂酰膽堿 美國(guó)Sigma公司；釩鉬酸銨顯色劑：稱取偏釩酸銨1.25g，加水200mL加熱溶解，冷卻后再加入250mL硝酸，另稱取鉬酸銨25g，加水400mL加熱溶解，冷卻，將兩種溶液混合，用水定容至1000mL，避光保存，若生成沉淀，則不能繼續(xù)使用。磷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精確稱取105℃干燥的磷酸二氫鉀(優(yōu)級(jí)純)0.2195g溶解于水中，定量轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中，加硝酸3mL，用水稀釋至刻度，搖勻，即為50μg/mL的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。所用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

MARS自動(dòng)壓力微波消解儀 美國(guó)CEM公司；Lambda型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 美國(guó)PE公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；超純水儀 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

取2～3枚禽蛋，去殼，將蛋黃和蛋白于勻漿機(jī)中充分混勻，裝入清潔容器內(nèi)，作為全蛋試樣。若測(cè)蛋黃含量，則取2～3枚禽蛋，去殼和蛋清，用濾紙吸干蛋黃表面的蛋清，將蛋黃于勻漿機(jī)中充分混勻，裝入清潔容器內(nèi)，作為蛋黃試樣。

1.3.2 樣品的預(yù)處理

稱取10g已經(jīng)制備好的樣品置于50mL離心管中，加入30mL無(wú)水乙醇，充分?jǐn)嚢杓s3min，離心，將乙醇溶液收集于250mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)圓底磨口瓶中。沉淀物再以無(wú)水乙醇洗滌兩次(方法同上)，合并乙醇提取液，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

準(zhǔn)確稱取0.3000g蒸發(fā)干的樣品于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸4mL、雙氧水1mL，靜置5min，旋緊密封蓋，將罐放入微波爐內(nèi)，在一定溫度和時(shí)間下進(jìn)行消解。消解完畢，取出消解罐冷卻后，將消解液轉(zhuǎn)移50mL容量瓶中，用水定容、搖勻待側(cè)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取磷標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL(相當(dāng)于磷含量 0、50、100、200、300、400、500μg)，分別置于50mL容量瓶中，加入10mL釩鉬酸銨顯色劑，定容、搖勻，靜置10min后，在可見(jiàn)分光光度計(jì)400nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[16]。以測(cè)出的吸光度對(duì)磷含量做標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為Y=0.08628X，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。

1.3.4 樣品的測(cè)定

移取10.0mL消解液于50mL容量瓶中，加入釩鉬酸銨顯色劑10mL，用水稀釋到刻度、搖勻(同時(shí)以釩鉬酸銨顯色劑為樣品空白)，靜置10min以上，用1cm比色皿在波長(zhǎng)400nm處測(cè)定其吸光度，在工作曲線上查得樣品溶液中的磷含量。

1.3.5 樣品含量計(jì)算

式中：X為依據(jù)回歸方程計(jì)算出的試樣中的磷含量/μg；m為禽蛋質(zhì)量/g；5為樣品稀釋倍數(shù)；25為磷換算成磷脂系數(shù)。

1.3.6 儀器工作條件

按照儀器說(shuō)明書(shū)要求，稱樣量為0.3g，自動(dòng)壓力微波消解儀的消解程序見(jiàn)表1。

表1 自動(dòng)壓力微波消解儀的消解程序Table 1 Digestion procedures of automatic pressure microwave digestion system

2 結(jié)果與分析

2.1 消解液組成體系的確定

常用的有機(jī)樣品消解液多為混合體系，主要有：HNO3+H2O2+HF、HNO3+H2O2、HNO3+HCl+H2O2、HCl+HNO3。高氯酸與有機(jī)物混合易爆炸，硫酸在高壓、高溫下易損壞消解罐，且形成不溶性化合物，鹽酸氧化性相對(duì)較弱，故選用硝酸和雙氧水對(duì)樣品進(jìn)行消解。消解液應(yīng)在消解前一次性加入。

2.2 微波消解加酸量的選擇

表2 微波消解正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental scheme and results of orthogonal array design for optimizing microwave digestion conditions

選擇本實(shí)驗(yàn)樣品消解過(guò)程中影響消解效果的兩個(gè)因素HNO3和H2O2的使用量，進(jìn)行2因素4水平正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2分析可知，樣品消解過(guò)程中HNO3的使用量為主要影響因素，其次是H2O2用量，最優(yōu)消解液為5mL HNO3和 2.5mL H2O2。

2.3 精密度和回收率

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)取同一品種的2～5個(gè)蛋打碎勻漿混勻，做7次平行實(shí)驗(yàn)，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行誤差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 卵磷脂含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of determining lecithin content in eggs by this method

由表3可以得出，7次平行實(shí)驗(yàn)求得卵磷脂含量的平均值為雞蛋2.94%、鴨蛋3.80%、鴿蛋4.68%，變異系數(shù)均低于2%，這表明實(shí)驗(yàn)具有很好的重復(fù)性，精密度高。

2.3.2 回收率實(shí)驗(yàn)

取已知卵磷脂含量的全蛋液做回收率實(shí)驗(yàn)，分別加入磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品0.010g和0.020g，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品的回收率Table 4 Recovery rates for lecithin in eggs

從表4可以看出，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)所建立的蛋中卵磷脂含量的微波消解測(cè)定方法的回收率均在90%以上，說(shuō)明此方法是可靠的。

2.3.3 微波法與傳統(tǒng)定磷法測(cè)定結(jié)果比較

取雞蛋全蛋樣品，用傳統(tǒng)定磷法[2]與微波法分別進(jìn)行平行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

通過(guò)微波消解法與傳統(tǒng)方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比(表5)可知，樣品在微波消化期間，基于消化瓶?jī)?nèi)壓力的緣故，會(huì)產(chǎn)生較高的溫度而得到較好的消化結(jié)果，使樣品的消解可以進(jìn)行得更精確、徹底。另外，密閉微波消解儀器通過(guò)溫壓控制可以保證消解的質(zhì)量，保證反應(yīng)一致的平行性和重復(fù)性。因此，微波消解法作為一種新興的先進(jìn)的樣品預(yù)處理方法，其應(yīng)用前景必定是十分廣闊的。

表5 傳統(tǒng)定磷法和微波法實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比分析Table 5 Comparative analysis of results of determining lecithin content in eggs by this method and the conventional method

3 結(jié) 論

3.1 在樣品預(yù)處理過(guò)程中，應(yīng)加入適量H2O2，以減少高壓罐中的氮?dú)猱a(chǎn)生量及升高溫度時(shí)加速樣品的消解。通過(guò)正交試驗(yàn)，考察了HNO3用量和H2O2用量對(duì)磷脂含量的影響，得出最優(yōu)加酸量為HNO35mL、H2O22.5mL。

3.2 本研究采用微波消解分光光度法測(cè)定禽蛋中的卵磷脂，改進(jìn)了樣品的前處理和樣品中脂質(zhì)的提取，操作簡(jiǎn)單，試劑用量少，準(zhǔn)確度高。為禽蛋中卵磷脂含量的測(cè)定提供了一種新方法。同時(shí)進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果令人滿意。

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Microwave Digestion-Visible Spectrophotometric Determination of Lecithin in Eggs

GE Qing-lian，WU Min，ZHANG Xiao-yan，TANG Meng-jun，PU Jun-hua，GAO Yu-shi，CHEN Kuan-wei*
(Poultry Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Yangzhou 225003, China)

Microwave digestion coupled with visible spectrophotometry was used to establish an analytical method for the determination of lecithin content in eggs. Eggs were homogenized and treated with ethanol to remove the phosphate protein,Followed by microwave digestion. The detection of lecithin was spectrometriacally performed at 400 nm. The mean spike recovery rates of the established method for lecithin in eggs from three species of poultry were above 90% with a coefficient of variation of less than 2%. This method displayed excellent accuracy and precision, had many advantages over the conventional method, such as less reagent consumption, ease of operation and low environmental pollution. Therefore, it might be an effective and practical method.

visible spectrometry；lecithin；eggs

TS253.7

A

1002-6630(2011)08-0194-03

2010-06-28

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(nyhyzx03-46)

葛慶聯(lián)(1971—)，女，助理研究員，碩士研究生，主要從事食品安全研究。E-mail：zsj10800@sina.com*通信作者：陳寬維(1955—)，男，研究員，主要從事遺傳育種及資源保護(hù)研究。E-mail：ckw@yzcn.net