鯉魚(yú)蛋白控制酶解及其酶解產(chǎn)物抗氧化研究

丁利君，張敏玲

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

鯉魚(yú)蛋白控制酶解及其酶解產(chǎn)物抗氧化研究

丁利君，張敏玲

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

以鯉魚(yú)為原料，利用枯草桿菌蛋白酶對(duì)鯉魚(yú)蛋白進(jìn)行控制酶解，制取富含多肽的酶解液，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行研究。以水解度、多肽含量、氨基酸含量、抗氧化性為指標(biāo)，對(duì)自由基清除率評(píng)價(jià)其抗氧化性。通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究酶解溫度、pH值、酶用量、酶解時(shí)間、料液比等因素對(duì)酶解過(guò)程的影響，并進(jìn)行三元二次回歸設(shè)計(jì)，對(duì)最佳的酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：以枯草桿菌蛋白酶對(duì)鯉魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，最佳工藝參數(shù)為酶解溫度62℃、酶用量100U/g、料液比1:2(g/mL)、pH7.0、酶解4h。此條件下，酶解液多肽含量為0.704mg/mL，對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率分別為73.41%和59.78%，酶解液有很好的抗氧化性。

鯉魚(yú)；多肽；酶解；抗氧化性

我國(guó)鯉魚(yú)分布廣泛，產(chǎn)量高，是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一。鯉魚(yú)是原產(chǎn)亞洲的溫帶性淡水魚(yú)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高[1]。但鯉魚(yú)大多用作家庭烹飪或初級(jí)加工，特別是廣東的鯉魚(yú)價(jià)格低廉，有必要進(jìn)一步提高其利用價(jià)值，提高其附加值[2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，活性多肽有比蛋白質(zhì)、氨基酸更多的生理活性[3-4]。Erdmann等[5]對(duì)食源性生物活性肽在降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)可能發(fā)揮的作用進(jìn)行了綜述，對(duì)乳源性生物活性肽、酪蛋白生物活性肽的研究比較多[6-7]，近年來(lái)對(duì)水產(chǎn)生物活性肽的研究也越來(lái)越多[8-9]?；钚噪木哂腥梭w代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有抗氧化[10]、促進(jìn)免疫、激素、酶抑制劑、抗菌、抗病毒、降血脂等作用，食用安全性高，是極具發(fā)展前景的功能因子。本實(shí)驗(yàn)以鯉魚(yú)為原料，采用生物酶解技術(shù)，利用枯草桿菌蛋白酶對(duì)鯉魚(yú)蛋白進(jìn)行控制酶解，研究酶解過(guò)程中水解度、多肽含量與其抗氧化性的關(guān)系，以期為鯉魚(yú)的深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鯉魚(yú)購(gòu)于廣州番禺市場(chǎng)。

TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司；KDC-40低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

枯草桿菌蛋白酶(酶活20000U/mL) 美國(guó)諾維信公司；三氯乙酸 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；雙縮脲試劑、茚三酮顯色劑、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠；鄰苯三酚(分析純) 天津福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 原材料預(yù)處理

魚(yú)經(jīng)去頭、尾、內(nèi)臟后，清洗、切塊、滅酶、異丙醇脫脂、瀝干，粉碎成碎魚(yú)肉，包裝、冷藏(－5℃)備用[11]。

1.2.2 酶解液制備方法

稱取一定量脫脂鯉魚(yú)碎魚(yú)肉，按一定比例加蒸餾水，調(diào)魚(yú)糜液pH值，加酶液恒溫酶解，滅酶、冷卻、離心(4000r/min、15min)，得酶解液，備用[11]。

1.2.3 總氮、可溶性蛋白的測(cè)定

總氮測(cè)定采用凱氏定氮法[12]，可溶性蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[13]。

1.2.4 多肽含量的測(cè)定

采用雙縮脲法[14]。取2.5mL酶解溶液，加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸，振蕩混合均勻，靜置10min，在4000r/min離心15min，將上清液用5%三氯乙酸定容到50mL。取6.0mL上述溶液置另一試管中，加入雙縮脲試劑4.0mL，混勻，靜置10min，2000r/min離心10min，取上清液于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中多肽含量。

1.2.5 氨基氮含量及水解度的測(cè)定

氨基氮含量的測(cè)定采用茚三酮法[15]。取酶解液稀釋100倍，取0.40mL稀釋液于試管中，加入1.60mL蒸餾水，1.00mL顯色劑，混勻，沸水浴加熱15min；同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)，冷卻，加入5.00mL 40%乙醇溶液混勻，放置15min后測(cè)定570nm處的吸光度。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶解液的氨基氮含量。

酶解溶液水解度DH的計(jì)算方法：DH/%=[氨基氮含量/總氮含量×6.25－0.33]/7.8×100

1.2.6 鯉魚(yú)蛋白酶解液對(duì)·OH清除率的測(cè)定

[16]方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 鯉魚(yú)蛋白酶解液對(duì)超氧陰離子自由基(O2－·)清除作用

采用鄰苯三酚氧化法進(jìn)行測(cè)定[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時(shí)間對(duì)鯉魚(yú)蛋白酶解效果的影響

稱取脫脂鯉魚(yú)碎魚(yú)肉，按料液比(即碎魚(yú)肉與水之比，g/mL)為1:2加入蒸餾水，調(diào)pH7.0，加酶量E/S為100U/g，于65℃酶解不同時(shí)間，滅酶、冷卻、離心(4000r/min，15min)，測(cè)定上清液即酶解液的多肽含量、水解度和對(duì)自由基的清除率(圖1)，研究酶解時(shí)間對(duì)鯉魚(yú)蛋白酶解效果的影響。結(jié)果表明，用枯草桿菌蛋白酶水解鯉魚(yú)蛋白，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)糜蛋白的水解度逐漸增加；酶解時(shí)間在4h前，酶解液中多肽含量、對(duì)自由基的清除率都隨著酶解的進(jìn)行而加大，但酶解時(shí)間超過(guò)4h，多肽含量隨著水解度的加大而逐漸下降，對(duì)自由基的清除作用也隨之下降。這是因?yàn)殡S酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽被繼續(xù)水解成氨基酸，酶解液對(duì)自由基的清除作用隨著酶解液中多肽含量的減少而降低，即多肽含量與對(duì)自由基的清除率有相關(guān)性，說(shuō)明對(duì)自由基的清除作用主要來(lái)源于酶解液中的多肽。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis, polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals

2.2 酶用量對(duì)鯉魚(yú)蛋白酶解效果的影響

圖2 酶用量對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Effect of enzyme dose on degree of hydrolysis, polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals

稱取脫脂鯉魚(yú)碎魚(yú)肉，按料液比1:2加入蒸餾水，調(diào)pH7.0，分別不同酶量，65℃酶解4h后滅酶，冷卻、離心(4000r/min、15min)、測(cè)定，研究酶用量對(duì)鯉魚(yú)蛋白酶解效果的影響。從圖2可以看出，酶用量為100U/g時(shí)，酶解液中多肽的含量最高。當(dāng)酶用量過(guò)少時(shí)，底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶的濃度，反應(yīng)系統(tǒng)中酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比，即v=k[E]。當(dāng)酶用量過(guò)大時(shí)，酶解液中的蛋白質(zhì)、多肽與酶作用的機(jī)會(huì)大大增加，分解為游離氨基酸。鯉魚(yú)蛋白酶解液對(duì)·OH和O2－·清除率隨酶解液多肽的增加而增大。加酶量在100U/g以上時(shí)，對(duì)水解度影響很小。

2.3 料液比對(duì)鯉魚(yú)蛋白酶解效果的影響

稱取脫脂鯉魚(yú)碎魚(yú)肉，按不同料液比加入蒸餾水，調(diào)pH7.0，加酶量100U/g，65℃酶解4h，滅酶、冷卻、離心，得酶解液，測(cè)多肽含量、水解度、抗氧化性，研究料液比對(duì)鯉魚(yú)蛋白酶解效果的影響。從圖3可以看出，料液比在1:2時(shí)，鯉魚(yú)蛋白酶解液中的多肽含量最高，對(duì)·OH和O2－·清除能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到62.10%和49.71%。

圖3 料液比對(duì)酶解效果的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on degree of hydrolysis,polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals

2.4 pH值對(duì)鯉魚(yú)蛋白酶解效果的影響

圖4 酶解pH值對(duì)酶解效果的影響Fig.4 Effect of pH value on on degree of hydrolysis, polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals

稱取脫脂鯉魚(yú)碎魚(yú)肉，按料液比1:2加入蒸餾水，調(diào)節(jié)不同pH值，加酶量100U/g，65℃酶解4h，滅酶、冷卻、離心，得酶解液，測(cè)多肽含量、水解度、抗氧化性，研究pH值對(duì)鯉魚(yú)蛋白酶解效果的影響。圖4結(jié)果表明，pH7.0時(shí)，酶解液的多肽含量最高，對(duì)自由基清除率最大，可見(jiàn)枯草桿菌蛋白酶作用于鯉魚(yú)蛋白的最適pH值是7.0。

2.5 溫度對(duì)鯉魚(yú)蛋白酶解效果的影響

圖5 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis,polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals

稱取脫脂鯉魚(yú)碎魚(yú)肉，按料液比1:2加入蒸餾水，調(diào)pH7.0，加酶量100U/g，在不同溫度酶解4h，滅酶、冷卻、離心，測(cè)定，研究酶解溫度對(duì)鯉魚(yú)蛋白酶解效果的影響。圖5結(jié)果表明，65℃時(shí)的水解度最大，對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到了最高值，酶解效果最佳，65℃是枯草桿菌蛋白酶作用于鯉魚(yú)蛋白的最適酶解溫度。

2.6 三元二次旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

考慮到酶解過(guò)程受到多因素之間的相互影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行三元二次旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)，因子水平編碼表見(jiàn)表1。根據(jù)三因子二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，用SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸分析，對(duì)鯉魚(yú)蛋白質(zhì)的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 因素水平編碼表Table 1 Coded factors and levels in ternary quadratic regression rotation design

表2 鯉魚(yú)蛋白控制酶解旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 2 Ternary quadratic regression rotation design scheme and corresponding experimental results

采用SPSS軟件，對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行分析[18]。表3結(jié)果表明，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.813，表明其方程的擬合度良好。方差分析F值的顯著性概率為0.011小于0.05，所以回歸達(dá)到顯著水平，說(shuō)明酶解液中多肽含量和其各因素之間存在顯著的回歸關(guān)系，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案正確，回歸方程式有意義，回歸方程為y=0.5－0.0882x1－0.0506x3。由此方程得出，采用枯草桿菌蛋白酶酶解鯉魚(yú)蛋白，各因素的最優(yōu)水平為酶解溫度62℃、酶用量100U/g、料液比1:2、pH7.0、酶解4h。在此條件下，測(cè)得酶解液中多肽含量為0.704mg/mL，水解度為55.43%，對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率分別為73.41%和59.78%。

表3 旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results generated by ternary quadratic regression rotation design

3 結(jié) 論

綜上所述，采用枯草桿菌蛋白酶對(duì)鯉魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，制備富含多肽的酶解液，酶解最佳條件為酶解溫度62℃、酶用量100U/g、料液比1:2、pH7.0、酶解4h，此條件下，測(cè)得酶解液中多肽含量為0.704mg/mL，水解度為55.43%，對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率分別為73.41%和59.78%。酶解液的多肽含量與其抗氧化活性有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)鯉魚(yú)蛋白的深加工有參考利用價(jià)值。

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Controlled Hydrolysis of Carp Protein and Antioxidant Activity of Its Hydrolysate

DING Li-jun，ZHANG Min-ling
(College of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China)

Carp protein was hydrolyzed by subtilisin to prepare hydrolysate rich in peptides, and its antioxidant activity was investigated by free radical scavenging assay. The effects of the hydrolysis conditions temperature, pH, enzyme dosage, reaction time and solid-to-water ratio on degree of hydrolysis, polypeptide content, amino acid content and the abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals were examined in single factor experiments. Further, ternary quadratic regression rotation design was employed to optimize temperature, enzyme dose and solid-to-liquid ratio for maximizing polypeptide content. The results showed that the optimum values of temperature, pH, enzyme dosage, reaction time and solid-to-water ratio were 62 ℃, 7.0, 100 U/g, 4 h and 1:2 (g/mL). The polypeptide content in the resultant hydrolysate under these conditions was 0.704 mg/mL, and its scavenging rates against hydroxyl and superoxide anion free radicals were 73.41% and 59.78%, respectively,suggesting excellent antioxidant activity.

carp protein；hydrolysis；polypeptides；antioxidant activity

TS201.21

A

1002-6630(2011)08-0070-04

2010-06-09

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2006B204010)；從化市科技計(jì)劃項(xiàng)目(從科2010B02-03)

丁利君(1965—)，女，教授，碩士，主要從事食品化學(xué)、食品加工研究。E-mail：ddddlj@gmail.com