杯碟法檢測乳中的β-內酰胺酶

薛曉晶，李 玲，金 涌，李 禮，王 芳，任香夫，田世民*

(中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123)

杯碟法檢測乳中的β-內酰胺酶

薛曉晶，李 玲，金 涌，李 禮，王 芳，任香夫，田世民*

(中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123)

采用微生物杯碟法對乳中β-內酰胺酶進行檢測?；谇嗝顾匾种铺冱S微球菌(Micrococcus luteus)生長并產生抑菌圈，利用舒巴坦特異性抑制β-內酰胺酶活性的特點，通過比較含青霉素樣品中加入和未加入舒巴坦所產生的抑菌圈直徑差異，間接判斷樣品中是否含有β-內酰胺酶。結果表明：青霉素G的最佳使用質量濃度為0.5μg/mL，β-內酰胺酶的檢測限因生產廠家隨標注單位不同而不一致，舒巴坦的最佳使用質量濃度為50μg/mL；在此基礎上確立杯碟法檢測β-內酰胺酶的優(yōu)化方案：設立陰陽性樣品對照組；并對同一樣品進行4個不同添加處理：青霉素G處理，青霉素G、舒巴坦處理，青霉素G、β-內酰胺酶處理，青霉素G、β-內酰胺酶、舒巴坦處理，通過比較4個不同處理產生的抑菌圈直徑差異，并同時參照陰陽性樣品對照組結果，判定樣品中是否存在β-內酰胺酶。

β-內酰胺酶；杯碟法；青霉素G；舒巴坦；乳

β-內酰胺酶[1-3]是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中β-內酰胺環(huán)酰胺鍵的滅活酶，即可選擇性分解β-內酰胺類抗生素。近些年，部分不法生產者將其作為“生鮮牛乳抗生素分解劑”使用，用于分解牛乳中殘留的β-內酰胺類抗生素，使牛乳達到乳品檢驗合格標準[4]。目前國內外對β-內酰胺酶的食用安全性還未得到證實，但是，經β-內酰胺酶分解后的抗生素分解產物可能對人體健康構成潛在威脅[5]，如β-內酰胺酶可使青霉素四元環(huán)開環(huán)，喪失抑菌活性，其分解產物青霉噻唑酸是引起人體青霉素過敏的主要物質之一[6-8]。衛(wèi)生部于2009年3月6日和23日相繼發(fā)布了關于印發(fā)《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治近期工作重點及要求》的通知(衛(wèi)監(jiān)督發(fā)〔2009〕21號)[9]和關于印發(fā)《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治抽檢工作指導原則和方案》的通知(食品整治辦〔2009〕29號)[10]，明確指出“添加β-內酰胺酶(解抗劑)等非食品用物質屬違法行為”。

國內記載或報道的有關β-內酰胺酶檢測方法[11-12]有頭孢硝基噻吩顯色法、酸度法、碘量法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和杯碟法。碘量法的檢出限較高，假陰性率高；高效液相色譜法前處理復雜，背景噪聲較大，假陽性率高；酶聯(lián)免疫法易受乳品中其他蛋白干擾等；杯碟法即微生物培養(yǎng)法被認為是可靠和準確的檢測方法[5-7]。杯碟法的原理是基于青霉素抑制藤黃微球菌(Micrococcus luteus)生長并產生抑菌圈的基礎上，利用舒巴坦特異性抑制β-內酰胺酶活性的特點，通過比較含青霉素樣品中加入和未加入舒巴坦所產生的抑菌圈直徑差異，間接判斷樣品中是否含有β-內酰胺酶。此法靈敏度高、操作簡便、結果判定簡單，基本可以滿足乳液及乳液制品中β-內酰胺酶的檢測需要。

在實驗中發(fā)現(xiàn)，不同廠家生產的β-內酰胺酶標準品，所用酶活性單位不一致。中國藥檢所和TCI公司β-內酰胺酶標準品單位均為“U”。前者對酶單位“U”未給出定義，后者給出的“1 U”定義為，在30℃、pH7.0時，每小時分解1IU青霉素為一個酶活性單位。Sigma公司β-內酰胺酶所用單位為國際單位“IU”，即在25℃、pH7.0時，每分鐘水解1.0μmol青霉素的酶活性。β-內酰胺酶酶活性單位的不統(tǒng)一，將會影響該酶檢測的可比性。鑒于以上原因，本實驗將對幾種不同品牌的β-內酰胺酶標準品進行比對實驗，確定其在杯碟法中的檢測限是否一致。

在此基礎上，本實驗對現(xiàn)有的杯碟法中涉及的青霉素G、舒巴坦、β-內酰胺酶檢測限等實驗參數(shù)進行驗證并優(yōu)化實驗方案，以提高方法的可操作性和檢測結果的穩(wěn)定性，為我國制定相應β-內酰胺酶檢測標準提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤黃微球菌[Micrococcus luteus CMCC(B) 28001] 國家醫(yī)學菌種保藏管理中心。

腦心浸液、抗生素鑒定培養(yǎng)基2號(pH6.5～6.6)、舒巴坦 北京陸橋技術有限責任公司；青霉素G Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；β-內酰胺酶 東京化學工業(yè)(TCI)公司、美國Sigma公司、中國藥品生物制品檢定所(中國藥檢所)；脫脂奶粉 美國BD公司。

1.2 儀器與設備

KB240培養(yǎng)箱 德國Binder公司；WNB21L水浴鍋德國Memmert公司；牛津杯(外徑8mm)；培養(yǎng)皿(90mm)。

1.3 方法

1.3.1 菌平板的制備

將藤黃微球菌單菌落接種于滅菌后的腦心浸液培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)18～22h，使菌濃度達到1×108CFU/mL。將此菌液按1:20(V/V)接種于50～55℃溫水浴的已滅菌抗生素鑒定培養(yǎng)基2號(pH6.5～6.6)中，充分混勻后用含菌培養(yǎng)基倒平板，約15mL/皿。待培養(yǎng)基凝固后，每培養(yǎng)皿上均勻放置4個牛津杯。

1.3.2 青霉素G最適使用質量濃度的選擇

用10g/100mL脫脂奶液配制不同質量濃度的青霉素G溶液，其質量濃度為1.00、0.50、0.25μg/mL?；靹蚝笥?.22μm濾膜過濾，分別加入放置于菌平板上的牛津杯中(200μL/杯)，同時設不含青霉素G的脫脂奶液為陰性對照，每組重復3皿。36℃培養(yǎng)18～22h。選擇抑菌圈直徑大小約為25～30mm的試樣組，其青霉素G質量濃度為實驗最適使用質量濃度。

1.3.3 β-內酰胺酶對青霉素G抑菌效果的影響及檢測限的確定

用10g/100mL的脫脂奶液配制不同酶用量的β-內酰胺酶/青霉素G混合溶液。β-內酰胺酶用量分別為：TCI組：5.00、2.50、1.00、0.50、0.25U/mL；Sigma組：5、1、0.5、0.1IU/L；中國藥檢所組：16、8、4、2、1U/mL。青霉素G所使用的質量濃度為選擇后的最適使用質量濃度。混勻后，分別加入放置于抗生素鑒定培養(yǎng)基上的牛津杯中(200μL/杯)，每組重復3皿，36℃培養(yǎng)18～22h。觀察抑菌圈直徑大小與青霉素最適濃度對照組的差異。

1.3.4 舒巴坦最適使用濃度的選擇

用10g/100mL脫脂奶液配制不同質量濃度的舒巴坦-β-內酰胺酶-青霉素G混合溶液。舒巴坦質量濃度分別為200、100、50、25μg/mL，β-內酰胺酶為檢測限的不同倍數(shù)濃度，青霉素G為最適使用質量濃度?；靹蚝蠓謩e加入放置于抗生素鑒定培養(yǎng)基上的牛津杯中(200 μL/杯)，每組重復3皿。同上培養(yǎng)后測量抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 青霉素G最適使用質量濃度的選擇

表1 不同質量濃度青霉素脫脂奶溶液的抑菌圈直徑Table 1 Diameters of inhibition zone produced under different concentrations of penicillin G

按1.3.2節(jié)方法得到不同質量濃度青霉素G抑菌圈直徑大小見表1。如表1所示，0.5μg/mL青霉素G產生的抑菌圈約為25～26mm，確定為本實驗研究的適用質量濃度。

2.2 β-內酰胺酶對青霉素G抑菌效果的影響及檢測限的確定

按1.3.3節(jié)方法得到不同公司的β-內酰胺酶對青霉素G抑菌效果(抑菌圈直徑)的影響及其檢測限見表2。

表2 含0.5μg/mL青霉素的不同β-內酰胺酶用量溶液的抑菌圈直徑Table 2 Diameters of inhibition zone under different concentrations of β-lactamase and 0.5μg/mL penicillin

如表2所示，β-內酰胺酶Sigma組中0.5IU/L組(抑菌圈直徑平均值為19.7mm)及更高用量組、TCI 組中0.5U/mL組(抑菌圈直徑平均值為23.3mm)及更高用量組、中國藥檢所組中2U/mL組(抑菌圈直徑平均值為20.2mm)及更高用量組，在含有0.5μg/mL青霉素G的脫脂奶溶液中所產生的抑菌圈與青霉素G對照組(抑菌圈直徑平均值為26.8mm)比較，直徑差異在3.0mm以上。參照衛(wèi)生部的判斷標準[7]，當抑菌圈直徑差異不小于3.0mm時即為“有顯著差異”。以此判斷上述3個濃度可分別確定為該廠家β-內酰胺酶的檢測低限。

2.3 舒巴坦最適使用質量濃度的選擇

按1.3.4節(jié)方法，以Sigma組的β-內酰胺酶實驗組為例，得到不同質量濃度的舒巴坦/β-內酰胺酶對青霉素G作用所產生的抑菌圈大小見表3。計算各組抑菌圈與未添加舒巴坦對照組的直徑差異見表4。

結果表明，25μg/mL舒巴坦-10.0IU/L β-內酰胺酶實驗組抑菌圈直徑為10.5mm，未添加舒巴坦-10.0IU/L β-內酰胺酶對照組未產生抑菌圈，按牛津杯直徑計算為8.0mm，兩組抑菌圈差異為2.5mm；50μg/mL舒巴坦-10.0IU/L β-內酰胺酶實驗組抑菌圈直徑為21.5mm，與對照組差異為13.5mm。以衛(wèi)生部方法標準判定，25μg/mL舒巴坦對10.0IU/L β-內酰胺酶(檢測低限乘以20倍)抑制作用不明顯；50μg/mL舒巴坦可以有效抑制Sigma組β-內酰胺酶10.0IU/L對0.5μg/mL青霉素G的分解作用。相同方法進行另外兩個品牌β-內酰胺酶實驗，結果50μg/mL舒巴坦可以有效抑制中國藥檢所組β-內酰胺酶40U/mL、TCI組β-內酰胺酶40U/mL的分解作用。總結以上結果，本實驗選擇舒巴坦的最適使用質量濃度為50μg/mL。

表3 含0.5μg/mL青霉素G、不同用量β-內酰胺酶(Sigma組)和舒巴坦脫脂奶溶液的抑菌圈直徑Table 3 Diameter of inhibition zone under different concentrations of sulbactam,β-lactamase (Sigma) and 0.5μg/mL penicillin G mm

表4 各組所產生抑菌圈直徑與未添加舒巴坦對照組抑菌圈直徑的差異Table 4 Difference in the diameter of inhibition zone between the presence of sulbactam at various concentrations and its absence mm

2.4 乳樣品中β-內酰胺酶的檢測方案及結果判定

在以上結果的基礎上，制定乳樣品中β-內酰胺酶的檢測方案。選用青霉素G母液質量濃度100μg/mL、舒巴坦母液質量濃度2mg/mL、Sigma公司的β-內酰胺酶母液酶用量0.02IU/mL。將待檢樣品充分混勻，調pH6.0～6.5。分別取1mL待檢樣品于4個1.5mL離心管中，標記A、B、C、D，每個樣品做3個平行，共12管。同時，每次檢驗均設陽性質控對照和陰性對照。陽性質控對照為添加有Sig ma公司的β-內酰胺酶濃度為0.5IU/L(檢測限)的10g/100mL脫脂奶液。陰性對照為10g/100mL脫脂奶液。制備操作同待檢樣品。

按照下列順序分別將青霉素G母液、β-內酰胺酶標準品母溶液、舒巴坦母液加入到樣品、陽性和陰性對照中：A(青霉素G 5μL)；B(青霉素G 5μL、舒巴坦25μL)；C(青霉素G 5μL、β-內酰胺酶25μL)；D(青霉素G 5μL、β-內酰胺酶25μL、舒巴坦25μL)。此時相應樣品中青霉素G質量濃度為5μg/mL、舒巴坦質量濃度為50μg/mL、Sigma公司β-內酰胺酶用量為0.5IU/L?；靹蚝?，將上述A～D試樣各200μL加入放置于檢驗用平板的4個牛津杯中，(36±1)℃培養(yǎng)18～22h后，測量其抑菌圈直徑。每個樣品，取3次平行實驗的平均值。

結果判定標準：陰性對照組的結果應為：A、B、D產生抑菌圈，且A、B抑菌圈直徑差異小于3mm，重復性良好；C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，且抑菌圈直徑差異大于等于3mm，重復性良好。陽性添加對照組的結果應為：B、D產生抑菌圈，且A抑菌圈直徑小于B抑菌圈直徑，差異大于等于3mm，重復性良好；C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，且抑菌圈直徑差異大于等于3mm，重復性良好。如為以上結果，則系統(tǒng)成立，檢測限(靈敏度)為0.0005IU/mL。

樣品組實際判定結果為：①B、D產生抑菌圈，且C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，抑菌圈直徑差異大于等于3mm，重復性良好時，A抑菌圈直徑小于B抑菌圈直徑，差異大于等于3mm，重復性良好，則判定該樣品檢出β-內酰胺酶，報告β-內酰胺酶檢驗結果為陽性；若A、B抑菌圈差異小于3mm，重復性良好，則判定該樣品未檢出β-內酰胺酶，報告β-內酰胺酶檢驗結果為陰性。②當樣品中A不產生抑菌圈且B產生的抑菌圈小于11mm或A、B均不產生抑菌圈，說明可能樣品中β-內酰胺酶酶用量過高，舒巴坦無法有效抑制酶的活性。此時應將樣品稀釋1 0倍，再進行檢測。

本實驗室用此方法檢測市場送檢48例樣品，檢出陽性樣品14例，檢出率為29.17%。

3 結論與討論

通過實驗結果分析，不同廠家生產的β-內酰胺酶其檢測限各不相同——Sigma組為0.5IU/L、TCI組為0.5U/mL、中國藥檢所組為2U/mL，說明酶的單位活性存在很大差異。這一現(xiàn)象與各個廠家所使用的酶活性單位及單位定義不一致有很大關系。制定β-內酰胺酶的檢測標準，首先必須確定酶的檢測限。在此酶活性單位的統(tǒng)一是一個重要問題。確定不同品牌的β-內酰胺酶活性單位的特定比例關系、單位換算公式以及酶在最適條件下的單位活性與實驗條件下的單位活性之間的差異，是今后研究的重點內容。

經觀察還發(fā)現(xiàn)，中國藥檢所組和TCI組的β-內酰胺酶均為液體，開封后酶活性降低較快，不易保存。Sigma公司的酶為干粉狀，易于保存，溶解后在較長時間內活性穩(wěn)定。根據(jù)實驗結果，建議在酶單位未統(tǒng)一之前，選用以國際單位IU為標準單位、以干粉狀態(tài)保存的Sigma公司的β-內酰胺酶作為實驗中使用的標準物質，以保證實驗結果的穩(wěn)定性和一致性。

在舒巴坦質量濃度的選擇上，衛(wèi)生部方法所采用舒巴坦質量濃度為25μg/mL，在本實驗中，此質量濃度對20倍于檢測限濃度的β-內酰胺酶抑制效果不顯著；50μg/mL舒巴坦對此濃度β-內酰胺酶的抑制效果非常顯著。本實驗使用的舒巴坦上限質量濃度為200μg/mL，50μg/mL舒巴坦遠遠低于上限質量濃度，此質量濃度本身不會引起實驗結果的偏差，且對β-內酰胺酶酶用量檢測上限更高。因此建議將舒巴坦質量濃度調整為50μg/mL用于實際檢測。

在藤黃微球菌培養(yǎng)中，崔生輝等[5]實驗中所使用的抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅰ(pH6.5±0.1)和Ⅳ(pH6.1±0.1)培養(yǎng)基，菌生長狀態(tài)不理想。本實驗改用抗生素鑒定培養(yǎng)2號(pH6.5～6.6)，菌生長良好。在檢測平板的制備中，放棄底層基礎培養(yǎng)基的鋪設，直接鋪倒含菌培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，避免了鋪設兩層培養(yǎng)基可能帶來的鋪板過厚、不均勻等問題，同時簡化操作程序，提高效率。經實驗比較，兩種鋪板方法所產生的實驗結果一致。

在檢測方案的設計方面，以衛(wèi)生部方法為基礎進行了兩點改進：一是添加了陽性對照組，該組樣品添加有檢測限濃度的β-內酰胺酶，以進一步確保實驗的有效性和穩(wěn)定性；二是將陰性/陽性對照組的溶液基質由水改為10g/100mL陰性脫脂奶液，使其與待檢測樣品的基質更為接近，保證了實驗條件的一致性。

總而言之，β-內酰胺酶的檢測方法研究還處于初期階段，微生物杯碟法作為一種傳統(tǒng)的檢測方法在檢測時長和精度上還存在著不足。此法只能滿足定性檢測的需要，在定量檢測研究方面還存著很大的空白。而樣品中存在的β-內酰胺酶除了人為添加外，還可能來源于微生物[5]，目前已知的各種檢測方法還無法對此兩種來源的β-內酰胺酶進行區(qū)分，這可能致使檢測中假陽性率偏高。為進一步完善β-內酰胺酶檢測方法，對酶的穩(wěn)定性、添加限量、定量檢測等多方面進行研究是下一步的研究內容。

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[9] 衛(wèi)生部. 關于印發(fā)《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治近期工作重點及要求》的通知(衛(wèi)監(jiān)督發(fā)[2009]21號)[EB/OL]. http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0056/38681.html.

[10] 衛(wèi)生部. 關于印發(fā)《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治抽檢工作指導原則和方案》的通知(食品整治辦[2009]29號)[EB/OL]. http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdj/s3594/200903/39650.htm.

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Detection ofβ-Lactamase in Milk Based on Cylinder Plate Method

XUE Xiao-jing，LI Ling，JIN Yong，LI Li，WANG Fang，REN Xiang-fu，TIAN Shi-min*
(Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

Here, we adopted microbiological cylinder plate method to detectβ-lactamase in milk. Since penicillin inhibits the growth of Micrococcus luteus, producing a zone of inhibition, the difference between the diameters of inhibition zone produced by penicillin alone and together with sulbactam, which specifically inhibits the activity of β-lactamase, will indirectly suggest whether or not a sample contains the enzyme. The optimum working concentration of penicillin G determined in this study was 0.5μg/mL. The influence ofβ-lactamase products from different manufacturers with different given units on the antimicrobial activity of penicillin G in liquid skim milk was evaluated, and the results showed that the limits of detection of the developed method for them were different. Addition of sulbactam at 50 μg/mL provided optimum detection of β-lactamase. Based on the above investigations, the optimum protocol for detecting β-lactamase by cylinder plate method in milk was that the presence or not ofβ-lactamase was identified based on differences in the diameter of inhibition zone among additions of penicillin G alone or in combination with sulbactam or/and β-lactamase to one sample together with the results from constructed positive and negative controls.

β-lactamase；cylinder plate method；penicillin G；sulbactam；milk

TS252.7

A

1002-6630(2011)04-0216-04

2010-03-26

薛曉晶(1981—)，女，實習研究員，碩士，研究方向為食品安全及生物檢測。E-mail：xxjing528@163.com

*通信作者：田世民(1964—)，男，研究員，博士，研究方向為食品安全及生物檢測。E-mail：shimintian@yahoo.com.cn