張 濤河南省安陽市食品藥品檢驗所，河南安陽 455000

LC-MS/MS法分析減肥保健食品中非法添加的酚酞

張 濤河南省安陽市食品藥品檢驗所，河南安陽 455000

目的 建立減肥保健食品中非法添加化學(xué)成分酚酞的檢測方法。 方法 采用LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，采用Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱，以含0.1%冰醋酸的20 mmol/L醋酸銨溶液為流動相A，以甲醇為流動相B，梯度洗脫，流速：0.2 mL/min；柱溫為35℃，電噴霧電離,正離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)測掃描方式對酚酞的母離子（m/z319）及其子離子（m/z197和225）進(jìn)行檢測。 結(jié)果 建立檢測減肥保健食品中非法添加的酚酞的檢測方法，檢測限低于0.06 ng。在抽取的70批次市售減肥保健食品中，19批次檢出了酚酞。 結(jié)論 該方法專屬性強、靈敏度高,可用于減肥保健食品中非法添加的酚酞的篩選與確證工作。

高效液相色譜-質(zhì)譜；檢測；保健食品；非法添加；酚酞

酚酞是一種瀉藥，在小腸堿性腸液中通過刺激腸壁內(nèi)神經(jīng)叢，使腸蠕動增加產(chǎn)生緩瀉作用，過量或長期濫用可使血糖升高,血鉀降低，造成電解質(zhì)紊亂,誘發(fā)心律失常、神志不清、肌痙攣以及倦怠無力等癥狀[1-2]。由于酚酞價格低廉，而且短時間有減肥效果，所以一些不法商家為牟取暴利，把酚酞非法添加到減肥保健食品中，對消費者造成危害。酚酞的分子式為C20H14O4，分子量為318.32，CAS號為77-09-8，其結(jié)構(gòu)式見圖1。

本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、多重反應(yīng)監(jiān)測掃描方式，建立了酚酞的篩選鑒定方法，為更好地打擊不法行為提供可靠的技術(shù)支撐。

圖1 酚酞的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 儀器

美國 Agilent Technologies 公司配備電噴霧離子源（ESI）的 6410 型三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（Mass Hunter Workstation Date Acquisition工作站），Agilent高效液相色譜系統(tǒng)（包括1200低壓四元泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱）；Waters高效液相色譜儀Alliance系統(tǒng)（包括2695低壓四元泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱，2996PDA二極管陣列檢測器，EmpowerⅡ色譜工作站）；Mettler AE-240型電子天平。

1.2 試藥

酚酞對照品來自中國藥品生物制品檢定所；樣品從市場購買；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 HPLC條件 液相用色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；液質(zhì)聯(lián)用色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；以含0.1%冰醋酸的20 mmol/L醋酸銨溶液為流動相A，以甲醇為流動相B，梯度洗脫見表1、2；液質(zhì)聯(lián)用流速為0.2 mL/min，液相為1 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10 μL；波長225 nm。

1.3.2 MS條件 ESI；正離子模式；多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描方式；毛細(xì)管電壓：4 kv；干燥氣流速：8.0 L/min；干燥氣溫度：350 ℃；四級桿霧化器壓力：30 psi；碰撞氣壓力：2 mtorr；檢測器電壓：1.5 kv；掃描間隔時間：0.1 s。

1.3.3 對照品溶液的配制 對照品儲備溶液：取酚酞對照品約25 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，甲醇適量，超聲15 min使之溶解，放冷至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。對照品溶液：分別精密量取對照品儲備溶液1 mL置于100、25、10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻；再精密量取對照品儲備溶液10 mL置于25 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得每 1 毫升中各含成分 0.005、0.020、0.050、0.200、0.500 mg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線對照品溶液。

表1 液相洗脫程序

表2 液質(zhì)聯(lián)用洗脫程序

1.3.4 樣品溶液的配制 取樣品適量（茶劑取1袋；膠囊劑取1次服用量，帶囊殼），置50 mL量瓶中，加甲醇30 mL，超聲15 min使溶解，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

1.3.5 對照品與樣品測定 取對照品溶液與樣品溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后，分別取10 μL注入液相色譜儀進(jìn)行初篩和初步定量，結(jié)果見圖2、3。根據(jù)初篩結(jié)果，稀釋對照和樣品溶液約為50 ng/mL，分別取10 μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀，按照LC-MS/MS測定條件進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4、5。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取上述對照品溶液，選用電噴霧離子源正離子化模式，直接進(jìn)樣，進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先，運行MS2 scan (一級全掃描方式)，可得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為319；然后再運行MS2 sim (選擇性離子監(jiān)測)優(yōu)化Fragmenator（碰撞誘導(dǎo)解離電壓），得到最佳的Fragmenator；最后進(jìn)行Product Ion（子離子掃描），選擇子離子及其最佳Collision Energy（碰撞能量）,選擇豐度最大的子離子為檢測離子，使MRM具有較高的靈敏度。在樣品測定中適當(dāng)增加離子對進(jìn)行篩選,使其具有更高的專屬性，可有效防止出現(xiàn)假陽性，結(jié)果見表3。

2.2 檢測限

取對照品溶液適量，加流動相稀釋，按上述液質(zhì)聯(lián)用條件進(jìn)行測定，以S/n=3，計算檢測限（LOD）為0.06 ng。

2.3 樣品測定結(jié)果

進(jìn)行樣品測定時，如樣品液相色譜圖中檢出與酚酞對照品保留時間一致的成分，應(yīng)進(jìn)行質(zhì)譜MRM確證，如果樣品的保留時間和特征離子及其產(chǎn)生的子離子均與對照品相同，則判斷該樣品中含有酚酞。在抽取檢驗的70批次樣品中，檢出有19批次添加了酚酞，檢出率達(dá)27%。

圖4 酚酞對照品的MS/MS圖

表3 酚酞的質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

圖5 樣品中酚酞成分的驗證MS/MS圖

3 討論

3.1 液相初篩

由于樣品有茶劑、膠囊劑，且內(nèi)含量無法準(zhǔn)確估量，為避免樣品濃度太大污染液質(zhì)聯(lián)用儀，所以先進(jìn)行液相初篩和初步定量，根據(jù)液相結(jié)果再調(diào)整濃度進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用確證。

3.2 流動相的選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)，采用C18柱，主要在以下幾種流動相的基礎(chǔ)上進(jìn)行探索性試驗：流動相Ⅰ：0.5%甲酸-乙腈（70∶30）[3]；流動相Ⅱ：0.1%甲酸和甲醇不同比例[4]；流動相Ⅲ：0.02 mol/L醋酸銨-0.1%醋酸水溶液/乙腈不同比例。

樣品有膠囊劑、茶劑，樣品成分復(fù)雜，為使酚酞和其他干擾成分有效分離，分別變換其中各成分比例、酸含量及酸種類進(jìn)行試驗。結(jié)果表明，以含0.1%冰醋酸的20 mmol/L醋酸銨溶液為流動相A，以甲醇為流動相B，梯度洗脫條件下，酚酞與樣品中其它成分分離較好，故選擇此流動相。

3.3 應(yīng)注意的問題

對照品與樣品濃度不要太高，否則殘留嚴(yán)重，需要較長時間的沖洗；所用樣品、玻璃儀器與試劑等要防止交叉污染，避免造成假陽性結(jié)果的出現(xiàn)[5]。

[1] 馬微，王海波，王強，等.減肥保健食品中非法添加酚酞和西布曲明的同時檢測 [J].食品科學(xué)，2010，31（4）：156-160.

[2] 曾濤.常用減肥藥物的不良反應(yīng)[J].中國藥事，2007，10（6）：599-601.

[3] 胡青，崔益泠，王柯，等.減肥類保健食品中非法添加酚酞定性定量檢測方法的研究 [J].中國藥學(xué)雜志，2007，42（8）：624-625.

[4] 李丹，文紅梅，崔福春，等. LC-MS/MS法快速篩選保健食品中非法添加的11種減肥化學(xué)成分[J].中國藥事，2009，23（4）：335-338.

[5] 吳衛(wèi)濤，李亮.減肥保健食品中非法添加鹽酸西布曲明的檢測[J].中國藥事，2010，19（18）：34-35.

Analysis of phenolphthalein illegally added into functional food by LC-MS/MS

ZHANG Tao
Anyang Institute for Food and Drug Control，Anyang 455000,China

ObjectiveTo develop a LC-MS/MS method for the identification of illegal addition of chemical substance Phenolphthalein in health food.MethodsLC-MS/MS method was adopted. The separation was achieved by using Zorbax Eclipse Plus C18column with gradient eluent composed of 2 mmol/L ammonium acetate containing 0.1% acetic solution-methanol. The flow rate was 0.2 mL/min and the column temperature was set at 35℃.The target compound was analyzed with mass spectrum in the Multiple- reaction monitoring mode via positive ion mode.ResultsThe illegal addition of chemical substance Phenolphthalein in health food was detected on the basis of mass spectra. The LOD was below 0.06 ng. Among the 70 samples,19 samples contained Phenolphthalein.ConclusionThe method is sufficiently selective and sensitive to detect the Phenolphth alein in health food.

LC-MS/MS;Detection;Health food;Illegal addition;Phenolphthalein

R917

A

2095-0616（2011）18-98-03

2011-07-15）