張劍峰，項崢，竇德強

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

血塞通注射液溶血檢測方法研究△

張劍峰，項崢，竇德強*

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

目的:篩選出一種較好的用于檢測中藥注射劑溶血的方法。方法采用肉眼觀察法、紅細胞計數(shù)法以及分光光度法對血塞通注射液溶血度進行測定。結果各種方法測定的結果有所差異。肉眼觀察法判斷沒有溶血或不明顯的結果，紅細胞計數(shù)法和分光光度法均可測定出具體數(shù)值，且結果在溶血趨勢上具有一定的一致性。紅細胞計數(shù)法測定每組的RSD值均大于5%，而分光光度法則均小于5%。結論分光光度法更方便、準確，適用于中藥注射劑溶血監(jiān)測使用。

溶血;不良反應;分光光度法

近年來，有關臨床上中藥注射劑不良反應的報道屢見不鮮，尋找出既簡便又有效的監(jiān)測方法迫在眉睫。其中對于中藥注射劑溶血性試驗， 《中國藥典》中規(guī)定采用肉眼觀察法對注射劑溶血進行評價[1]。此法雖簡便、易行，適用于溶血明顯的樣品，并給出定性判斷，但由于其通過肉眼來觀察，有時又受到注射劑本身顏色的影響及少量溶血時觀察不明顯，溶血情況很難判斷，主觀誤差影響較大。因此，肉眼觀察法已經(jīng)不能對各種程度的溶血做出準確的判斷，需尋找出一種更有效、簡便的方法。據(jù) 《藥物研究技術指導原則》[2]以及文獻[3，4]報道， 還有紅細胞計數(shù)法、分光光度法、體內(nèi)溶血試驗法以及乳酸脫氫酶活性測定法4種溶血測定方法，乳酸脫氫酶活性測定法用于診斷臨床血液病，而非用于中藥注射劑溶血檢測，因此本實驗未對其進行討論研究。

由于皂苷類成分多具有溶血作用，其與血紅細胞壁上的膽甾醇結合生成不溶性分子復合物沉淀，造成血紅細胞正常滲透性被破壞而發(fā)生破裂，進而產(chǎn)生溶血[5]，因此在一定程度上影響了其臨床使用。本實驗以主要成分為三七總皂苷的血塞通注射液為例，分別采用紅細胞計數(shù)法，分光光度法以及常規(guī)肉眼觀察法對血塞通溶血度測定并對各種方法加以比較，找出有效、簡便、穩(wěn)定的方法，為監(jiān)測中藥注射劑溶血反應提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2100分光光度計(上海 UNICO公司)，TDZ4-WS臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，Matrix CellMate II移液器，dragon-med可調(diào)式移液器(大龍醫(yī)療設備上海有限公司)，紅細胞計數(shù)板，OLYMPUSBX50顯微鏡，HH-S型水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

1.2 試劑

氯化鈉注射液(赤峰榮濟堂藥業(yè)有限公司，批號:09123843)，血塞通注射液(哈爾濱珍寶制藥有限公司，規(guī)格:2mL∶0.1g，批號:20091108 43，20091128 41)。

1.3 動物

家兔(購于大連大學動物室)。

2 方法

2.1 實驗條件

參考 《中國藥典》 規(guī)定[1]以及先前實驗結果[6]并經(jīng)考察，確定實驗條件為:1.1%血細胞懸液2.5 mL，3.5 mL不同濃度血塞通注射液及氯化鈉注射液混合液，(37±0.5)℃水浴2 h后采用肉眼觀察法以及血細胞計數(shù)法評價其溶血程度。以分光光度法測定同樣樣品時，對樣品離心10 min(轉速為3 000 r·min-1)，離心后取上清液，575 nm處測定吸光度[7]，同時設立陰性對照組及陽性對照組。

2.2 1.1%紅細胞混懸液制備

少量玻璃珠放入潔凈燒杯，將健康家兔耳緣靜脈取血于其中，輕輕不斷搖晃。去除纖維蛋白后，用滴管將血液移至刻度離心管中。以氯化鈉注射液洗滌，離心，除去上層液體。反復操作至上清液無色澄清為止，所得的紅細胞以生理鹽水配制成1.1%的紅細胞混懸液，并于當天用于實驗，用時搖勻。

2.3 溶液配制方法

取血塞通注射液 0.1， 0.3， 0.5， 0.7， 0.9，1.1 mL，加入到不同試管中，用氯化鈉注射液補充反應總體積至3.5 mL，作為供試品管。另取新鮮蒸餾水3.5 mL作為陽性對照管，氯化鈉注射液3.5 mL作為陰性對照管。上述各管分別加入1.1%紅細胞混懸液2.5 mL，輕輕混勻。另向新試管中加入與各試驗管內(nèi)相同含量的血塞通注射液，并加入適量氯化鈉注射液使體積達到6 mL，作為供試品對照管。見表1。

表1 各試驗組溶液配比/mL

2.4 肉眼觀察法

將37℃水浴2 h后的各管取出，對陽性對照管、陰性對照管、每組供試品管及其供試品對照管進行顏色觀察，通過肉眼來判斷溶血情況。試管中的溶液呈澄明紅色，管底無或者有少量細胞殘留，表明有溶血發(fā)生;紅細胞全部沉淀，且上清液無色澄明，或者有色澄明，但供試品管和陰性對照管或供試品對照管顏色無明顯差異，則表明無溶血發(fā)生。

2.5 紅細胞計數(shù)法

將目視法觀察后的每組試管搖勻，分別吸取一滴滴于細胞計數(shù)板上(由于最終確定值為比例值，為了使數(shù)據(jù)更具有廣泛性，本實驗未對樣品進行稀釋。)。待沉降完全，在低倍鏡下觀察計數(shù)板內(nèi)的紅細胞分布是否均勻。確定均勻后把計數(shù)板中央的大方格置于視野中，將顯微鏡調(diào)成高倍鏡觀察，計數(shù)5個中方格(總共80個小方格)內(nèi)的紅細胞數(shù)量。為避免計數(shù)重復或遺漏，壓在線上的紅細胞，本實驗只記錄方格4條線中上側線和左側線。最后計算每組試驗管的紅細胞數(shù)與陰性管的紅細胞數(shù)的比值。溶血度(%)=(1-試驗管紅細胞數(shù)/陰性管紅細胞數(shù))×100%。每組共做6份樣品，每份樣品取樣2次，求平均值。最終求6份樣品的平均值與RSD值，并計算溶血度。

2.6 分光光度法

根據(jù)血細胞釋放出來的血紅素在575 nm的條件下有最大吸收[6]，采用分光光度法測定每組樣品的吸光度，來反映血塞通注射液溶血度。將37℃水浴2 h后的每組試管離心10 min(3 000 r·min-1)，后將各組試管內(nèi)的上清液吸于比色皿內(nèi)，在575 nm下以陰性對照管為空白，記錄其余各管的吸光度。溶血度(%)=[(A試驗管-A陰性管)/(A陽性管-A陰性管)]×100%，A為樣品吸光度值。求出每組平均值，計算RSD值與溶血度。

3 結果

3.1 肉眼觀察結果

經(jīng)與陰性對照管、陽性對照管和供試品對照管對比后，相同濃度下不同批號血塞通注射液肉眼觀察溶血情況大致相同，結果見表2。

表2 肉眼觀察法檢測血塞通注射液溶血結果

3.2 紅細胞計數(shù)法溶血度測定結果

對于兩種批號的血塞通注射液溶血度的測定，紅細胞計數(shù)法測得的溶血度與血塞通注射液濃度呈一定的正相關性。即隨著注射劑濃度的增大，溶血度增大。測得每組溶血度的RSD值均大于5%。結果見表3、4。

表3 紅細胞計數(shù)法測定血塞通注射液溶血度結果(20091108 43)/%

表4 紅細胞計數(shù)法測定血塞通注射液溶血度結果(20091128 41)/%

3.3 分光光度法溶血度測定結果

分別對兩批血塞通注射液的溶血度采用分光光度法測定的結果表明，測得的溶血度也隨著血塞通注射液的濃度增高而增高。與紅細胞計數(shù)法相比，相同給藥劑量下分光光度法計算出的溶血度小，且每組RSD值均小于5%。結果見表5、6。

表5 分光光度法測定血塞通注射液溶血度結果(20091108 43)/%

表6 分光光度法測定血塞通注射液溶血度結果(20091128 41)/%

3.4 3種測定方法結果比較

實驗結果顯示，肉眼觀察判斷有溶血的樣品，紅細胞計數(shù)法測定的溶血度均大于75%，分光光度法測定的溶血度則大于50%;肉眼判斷不溶血或不確定溶血的樣品，紅細胞計數(shù)法測定的溶血度在0%～75%，分光光度法測定的溶血度則在0%～50%。同種方法對不同批號血塞通注射液的溶血度測定，結果差別不大;而不同方法對同一批號血塞通注射液測定，結果差異較大，但趨勢相似，結果見表7。以每試管中加入血塞通注射液在整個反應體系中的濃度為橫坐標，溶血度為縱坐標，分別對同種方法測定不同批號血塞通注射液、不同方法測定同一批號血塞通注射液進行作圖分析，見圖1～4。

表7 不同方法測定血塞通注射液溶血度結果(x±s)/%

圖1 分光光度法測定血塞通注射液溶血度變化圖

圖2 紅細胞計數(shù)法測定血塞通注射液溶血度變化圖

圖3 紅細胞計數(shù)法與分光光度法測定血塞通注射液溶血度對比圖(20091108 43)

圖4 紅細胞計數(shù)法與分光光度法測定血塞通注射液溶血度對比圖(20091128 41)

4 結論與討論

實驗結果表明，肉眼觀察法可判定產(chǎn)生溶血的樣品，用分光光度法測定其溶血度都在50%以上，紅細胞計數(shù)法測定的溶血度在75%以上;對于肉眼觀察法觀察溶血不明顯，結論不確定或者不溶血者，分光光度法測定溶血度在0%～50%，而細胞計數(shù)法則在0%～75%。這與文獻[8，9]報道結果大致相同。但對于介于溶血不明顯或不能確定的樣品，不同人的觀察判斷結果不同。因此，肉眼觀察法對結果的判斷受主觀影響的誤差較大。

《中國藥典》規(guī)定采用肉眼觀察法對中藥注射劑溶血進行觀察。此法雖簡便，省時，但適用于溶血現(xiàn)象明顯的樣品。由于其通過肉眼來觀察，有時又受到注射劑本身顏色和部分血細胞破裂后釋放出的血紅素顏色的影響，主觀誤差對結果產(chǎn)生的影響較大。而《藥物研究技術指導原則》[2]中對分光光度法測定溶血試驗的參考指標明確指出，當溶血率＞5%時，表明有溶血發(fā)生，此時本實驗中肉眼觀察法結果卻為陰性。因此肉眼觀察法對中藥注射劑溶血反應發(fā)生程度無法給予準確判斷，需尋找出適宜的方法代替肉眼觀察法。

結合《中國藥典》與文獻[6，7]，本實驗最開始對部分影響溶血測定的因素進行了考察。為平行對照肉眼觀察法與另外兩種溶血檢測方法，水浴溫度參照《中國藥典》規(guī)定，選取(37±0.5)℃。以陰性對照組和陽性對照組為試驗管分別對保溫時間為30，45，60，90，120，150 min進行了考察，結果表明，陰性對照組水浴150 min內(nèi)不發(fā)生自然衰敗，而陽性對照組在30 min內(nèi)即產(chǎn)生全溶血，并且隨時間的增加，其吸光度值不再改變。而實驗過程中發(fā)現(xiàn)，加入一定量血塞通注射液的供試品隨著水浴時間延長，其溶血度也逐漸增大。因此，選用120 min水浴時間，同文獻[7]報道半小時水浴時間相比，其優(yōu)勢在于便于觀察低劑量注射液溶血反應情況且樣品用量少;降低由于人為操作時間差異而引起的誤差;同時由于反應時間相對較長，更有利于觀察血塞通注射液對紅細胞混懸液的影響。本實驗又對離心速度和時間進行了考察。選用離心時間為10 min，轉速分別為1 000， 2 000， 3 000， 4 000 r·min-1，結果發(fā)現(xiàn)1 000，2 000 r·min-1仍可以觀察到離心不完全的現(xiàn)象，3 000 r·min-1時10 min就可達到完全分離效果，4 000 r·min-1也可達到完全分離，但因轉速較高，為避免離心速度過快而造成外力溶血，故選用離心速度為3 000 r·min-1，離心時間為10 min。因此確定實驗條件為水浴溫度(37±0.5)℃，水浴時間2 h，離心速度3 000 r·min-1，離心時間10 min。

紅細胞計數(shù)法與肉眼觀察法相比，不受主觀誤差的影響，但是實驗操作繁瑣，觀察時間較長，在測定過程中紅細胞易發(fā)生自身破裂，且對于滴于計數(shù)板上的樣品內(nèi)紅細胞分布要求均勻，一旦不均勻則需重新測定，此過程又可造成一些血細胞破裂。此外，如表3、4所示，紅細胞計數(shù)法的測定結果顯示其RSD值均較大，表明其精密度差，會造成測量值不準確，因此對注射劑溶血的檢測實用性較低。

分光光度法同其他兩種方法相比，其優(yōu)勢在于實驗操作簡便，測量時間短，且能給出定量結論。即使注射劑顏色較深，也可用供試品對照溶液來校正，大大減小主觀誤差影響。表5、6結果顯示，每組實驗的RSD值均小于5%，故分光光度法的精密度好。測量結果值準確，誤差較小。因此適用于檢測中藥注射劑溶血度。

如圖3、4所示，紅細胞計數(shù)法與分光光度法相比，兩者對溶血度上升趨勢的測定有一定的一致性，即隨著血塞通注射液濃度的增加，兩者的溶血度測量值也相應地增高。但紅細胞計數(shù)法得到的溶血度通常大于分光光度法的結果，這可能由于采用紅細胞計數(shù)法操作過程繁瑣且耗時較長引起紅細胞的破裂而造成溶血度偏高。因此采用分光光度法測定血塞通注射液的溶血度更簡便、快捷、誤差小，分光光度法更適合用于檢測中藥注射劑溶血反應。

[1]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄92.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局.藥物研究技術指導原則(中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術指導原則)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005:230.

[3]章寶娟.中藥注射劑溶血性試驗方法的研究概述[J].海峽藥學，2007，19(8):79-81.

[4]任國慶，牛海玲.血液病患者血清乳酸脫氫酶濃度變化的臨床意義[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2010，19(1):100.

[5]匡海學.中藥化學[S].北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003:242.

[6]楊光，項崢，康廷國，等.人參皂苷溶血測定的實驗條件研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2008，10(6):190-191.

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[9]周燕文，何淑華，莫武寧.中藥注射劑溶血度測定的3種方法比較[J].中國中藥雜志，2002，27(6):465-467.

Study on Detecting Methods of Haemolysis for Xuesaitong Injection

ZHANG Jian-feng，XIANG Zheng，DOU De-qiang
(College of Pharmacy Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian116600，China)

Objective:To find a better method for detecting the haemolysis of Traditional Chinese Medicine Injections.Methods:Apply macroscopic observation，cytometry and spectrophotometry to determine the haemolytic degree of Xuesaitong Injection.Results:The data given by different methods varied from each other.The results given by visual inspection，which showed little or unclear haemolysis phenomena，can be got in specific value by the other two methods.Meanwhile，cytometry and spectrophotometry have coherence in the uptrend of haemolysis.All the relative standard deviation(RSD)of different groups got from cytometry were more than 5%while spectrophotometry were less than 5%.Conclusion:Spectrophotometry is more convenient and suitable than the other two in inspection of haemolytic degree of TCM Injections.

Haemolysis;Adverse drug reaction;Spectrophotometry

高等學校博士學科點專項科研基金課題(20092133110001)，國家自然科學基金項目(30973859)，遼寧省高等學校優(yōu)秀人才支持計劃項目(2008RC34)

*竇德強，E-mail:doudeqiang2003@yahoo.com.cn

2010-06-19)