李 健，王 旭，劉 寧，陳姝娟

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076)

綠豆提取液的抗內(nèi)毒素作用及提取工藝優(yōu)化

李 健，王 旭，劉 寧，陳姝娟

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076)

研究了綠豆提取液對細(xì)菌內(nèi)毒素的清除作用，利用終點顯色基質(zhì)法測定內(nèi)毒素的含量。結(jié)果表明，綠豆提取液在體外具有抗內(nèi)毒素的作用，并以內(nèi)毒素的清除率為標(biāo)準(zhǔn)，探討了不同提取因素對提取效果的影響，最終確定提取條件為乙醇濃度70%，溫度60℃，提取時間2h，料液比1∶20，提取物中抗內(nèi)毒素有效成分含量最高。最后通過兩相萃取分離，發(fā)現(xiàn)綠豆中抗內(nèi)毒素成分主要集中在正丁醇提取物中。

綠豆，抗內(nèi)毒素，提取

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

綠豆 市售;無水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等 均為國產(chǎn)分析純;鱟試劑盒 廈門鱟試劑廠。

DWF-100型植物粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)有限公司;LD4-2A型離心機 北京醫(yī)用離心機廠;721型分光光度計 上海光譜儀器有限公司;JD5000-2型分析天平 沈陽龍騰電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 綠豆→磨粉→過100目篩→70%乙醇60℃水浴回流→三層紗布過濾→濾液離心→50℃減壓濃縮→真空干燥→綠豆總提取物→鱟實驗

1.2.2 測定方法 終點顯色法測內(nèi)毒素的含量［4］。

1.2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.3.1 濃度的稀釋 取細(xì)菌內(nèi)毒素工作品1支，用細(xì)菌內(nèi)毒素工作品用水稀釋為10EU/mL的內(nèi)毒素溶液，再稀釋為1.0EU/mL的內(nèi)毒素溶液，以1.0EU/mL的內(nèi)毒素溶液為母液依次稀釋為 1.0、0.5、0.25、0.1EU/mL的濃度梯度。

1.2.3.2 操作方法 取無熱源試管，分別加入200μL 10EU細(xì)菌內(nèi)毒素溶液和綠豆提取液，55±2℃水浴37min，再加入鱟試劑溶液，混勻，溫浴37min。再加入500μL偶氮化試劑1溶液，混勻。再依次加入偶氮化試劑2和偶氮化試劑3各500μL，混勻，靜置5min，于545nm波長處讀取吸光度值，吸光度值越小說明提取液的內(nèi)毒素清除率最高。

1.2.4 綠豆提取液萃取工藝研究 以綠豆提取液的內(nèi)毒素清除率為標(biāo)準(zhǔn)，探討乙醇濃度、提取溫度、時間、物料比對提取工藝的影響，確定最佳提取工藝條件。

1.2.4.1 乙醇濃度對萃取效果的影響 稱取綠豆干粉5份，以1∶10的比例分別加入30%、50%、70%、80%、90%的乙醇，60℃水浴回流提取4h，過濾，低于50℃濃縮，進(jìn)行鱟實驗，測吸光度值。

1.2.4.2 溫度對對萃取結(jié)果的影響 稱取綠豆干粉5份，以1∶10的比例加入60%的乙醇，分別在40、50、60、70、80℃水浴回流提取4h，過濾，低于50℃濃縮，進(jìn)行鱟實驗，測吸光度值。

1.2.4.3 提取時間對萃取效果的影響 稱取綠豆干粉5份，以1∶10的比例加入70%的乙醇，60℃水浴回流，提取時間分別為2、3、4、5、6h，過濾，低于50℃濃縮，進(jìn)行鱟實驗，測吸光度值。

1.2.4.4 料液比對萃取效果的影響 稱取綠豆干粉5份，分別以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的比例加入60%的乙醇，60℃水浴回流提取4h，低于50℃濃縮，進(jìn)行鱟實驗，測吸光度值。

1.2.5 不同溶劑萃取物對內(nèi)毒素的清除作用 取乙醇提取物，用蒸餾水溶解。用石油醚萃取三次除脂類，分別用三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，濃縮各部分，進(jìn)行鱟實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

見圖1。

圖1 內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 乙醇濃度對萃取效果的影響

吸光度值越小，內(nèi)毒素殘留越少，提取物的清除內(nèi)毒素作用效果越好，說明綠豆提取物中含有的抗內(nèi)毒素成分就越多。由圖2可以看出，隨著乙醇濃度的不斷增大，綠豆中抗內(nèi)毒素活性成分呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，當(dāng)乙醇濃度為70%時，提取效果最佳。當(dāng)乙醇濃度超過70%時，提取物中有效成分減少，這可能是由于其他醇溶性物質(zhì)增加，與有效成分競爭同乙醇-水分子結(jié)合，從而導(dǎo)致有效成分的提取量下降。

圖2 乙醇濃度對萃取效果的影響

2.3 提取溫度對萃取結(jié)果的影響

溫度對于提取率有非常顯著的影響。由圖3可以看出，在40～60℃時，隨著溫度的升高，綠豆中抗內(nèi)毒素成分不斷地被萃取出來。當(dāng)超過60℃時，達(dá)到了乙醇的沸點，提取溫度太高，使其中的活性成分破壞，且雜質(zhì)的溶出量增加。因此，最佳萃取溫度定為60℃。

圖3 提取溫度對萃取結(jié)果的影響

2.4 提取時間對萃取結(jié)果的影響

由圖4可以看出，萃取時間越長，萃取效果越好。2h后，曲線下降緩慢。從綜合提取效率方面考慮，提取時間定為2h。

圖4 提取時間對萃取結(jié)果的影響

2.5 料液比對萃取結(jié)果的影響

乙醇能穿透綠豆粉末的細(xì)胞膜，溶解溶質(zhì)，形成細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)濃度差，將溶質(zhì)滲出細(xì)胞膜，達(dá)到提取目的。料液比越大，滲透壓越大，溶質(zhì)更容易溶出。由圖5可以看出，當(dāng)料液比在1∶20之后，料液比對提取效果影響不大，曲線變緩，考慮到實驗條件的影響，確定料液比為1∶20。

圖5 料液比對萃取結(jié)果的影響

2.6 不同溶劑萃取物對內(nèi)毒素的清除作用

由圖6可知，乙醇提取物經(jīng)過不同的溶劑萃取，正丁醇的萃取物對內(nèi)毒素的清除作用最強。由此可以斷定，綠豆中清除內(nèi)毒素的有效成分主要集中于正丁醇萃取物中。

3 結(jié)論

綠豆提取液具有體外清除細(xì)菌內(nèi)毒素的作用，不同的提取條件均能影響提取物中清除內(nèi)毒素有效成分的含量。經(jīng)研究利用70%的乙醇，料液比1∶20，60℃條件下提取2h，綠豆中清除內(nèi)毒素的有效成分提取效果理想。通過兩相萃取，證明有效成分主要集中于正丁醇提取物中。

圖6 不同溶劑萃取物對內(nèi)毒素的清除作用

［1］趙守訓(xùn)，黃泰康，丁志尊.中藥辭海［M］.第三卷.北京:中國醫(yī)藥科技出版，1997:642-643.

［2］沈連生主編.本草綱目［M］.北京:華夏出版社，2004:199.

［3］雷黎明，潘清平.板藍(lán)根化學(xué)、藥理、質(zhì)量及提取方法的研究進(jìn)展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(10):2579.

［4］國家藥典委員會.中華人們共和國藥典［M］.第一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:79.

Study on anti-endotoxin of mung bean extraction and optimization of extraction processing

LI Jian，WANG Xu，LIU Ning，CHEN Shu-juan
(College of Food Engineering，Harbin Commerce University，Harbin 150076，China)

The clearing effect of extraction from mung bean on the bacterial endotoxin was investigated in vitro.The results indicated that extraction from mung bean could clear the bacterial endotoxin in vitro with displaying color in the end.And the influences of different factors on extracted efficiency were discussed.The conditions of 60℃，70% ethanol，solid-liquid ratio of 1∶20，extracting for 2h were optimized.And it was found that the effective components existed in the extraction of chloroform through extracting in the two-phase.

mung bean;anti-endotoxin;extraction

TS201.1

A

1002-0306(2011)03-0310-03

綠豆(Mung bean)，又名青小豆、錄豆、植豆，為一年生草本植物的種子。綠豆性味甘寒，具有清熱解毒之功效?！堕_寶本草》記載［1］:“綠豆，甘，寒，無毒。入心、胃經(jīng)。主丹毒煩熱，風(fēng)疹，熱氣奔豚，生研絞汁服，亦煮食，消腫下氣，壓熱解毒”?！毒幈静菥V目》云［2］:“綠豆，消腫治痘之功雖同于赤豆，而壓熱解毒之力過之。且益氣、厚腸胃、通經(jīng)脈，無久服枯人之忌。外科治癰疽，有內(nèi)托護(hù)心散，極言其效”。內(nèi)毒素即脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，由保守的毒性脂質(zhì)A部分、核心糖脂和特異的O側(cè)鏈組成，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分。內(nèi)毒素侵入機體血流，可觸發(fā)體內(nèi)一系列病理生理過程而引起發(fā)熱、膿毒性休克、彌漫性血管內(nèi)凝血以致死亡，中醫(yī)把LPS看成“熱毒”“邪毒”的物質(zhì)基礎(chǔ)。現(xiàn)代研究認(rèn)為，中藥材的清熱解毒功效主要集中于有效成分抗內(nèi)毒素作用和抗病原微生物作用［3］。本文主要研究了綠豆提取液的體外抗內(nèi)毒素作用，并以內(nèi)毒素的清除率為指標(biāo)，對提取液的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

2010-05-27

李健(1956-)，男，教授，主要從事食品化學(xué)方面的研究。

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