瘤果黑種草子的提取工藝優(yōu)選△

肖瓊，姜林，李曉瑾，王月娥

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830054）

瘤果黑種草子的提取工藝優(yōu)選△

肖瓊1，2，姜林1，3，李曉瑾2*，王月娥1，2

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830054）

目的：篩選瘤果黑種草子的最佳提取工藝條件。方法：以蘆丁含量和醇提浸膏得率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)法，考察醇提的工藝條件，即加醇量、提取時(shí)間、提取次數(shù)。結(jié)果：最佳提取工藝為加醇16倍，煎煮2次，每次1h。結(jié)論：該研究試驗(yàn)結(jié)果可靠，最佳工藝條件適合批量生產(chǎn)。

黑種草子；蘆?。徽辉囼?yàn)；提取工藝

黑種草子系維吾爾族習(xí)用藥材，為毛茛科植物瘤果黑種草Nigella glanduliferaFreyn.的干燥成熟種子［1］。黑種草子具有多種生理活性，如：抗菌［2］、抗氧化［3］、抗血小板聚集［4］、抗腫瘤、降脂、降糖、保肝作用［5］等。至今新疆已研制出用于治療脫發(fā)、斑禿、頭皮疹癢的復(fù)方斯亞旦生發(fā)油和酊兩種制劑，療效已在臨床研究中得到證實(shí)［6］。近年來(lái)，已有一些關(guān)于黑種草子化學(xué)成分的報(bào)道，研究表明，黑種草子中除了富含揮發(fā)油和脂肪酸外，還含有黃酮類化合物［7］、皂苷類化合物［2］、生物堿類化合物［2］等有機(jī)化合物。文獻(xiàn)報(bào)道該藥材中具有黃酮類成分［2，7，8］，試驗(yàn)進(jìn)行時(shí)，《中國(guó)藥典》2010年版還未出版，《中國(guó)藥典》2005年版中黑種草子項(xiàng)下無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，所以選擇了較為常見(jiàn)的黃酮類成分蘆丁為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用單因素考察結(jié)合正交試驗(yàn)的方法研究了影響瘤果黑種草子的主要因素，以浸膏得率和蘆丁的含量為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，篩選最佳提取工藝條件。

1 儀器與材料

LC-2010CHT型高效液相色譜儀（日本島津公司），DK-S24電熱恒溫水浴鍋，Metter AE163電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

黑種草子購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200707）。甲醇（美國(guó)Fisher公司，色譜純），磷酸（西安化學(xué)試劑廠，分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆丁含量測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C18（100A，4.60 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇－0.1%磷酸溶液（40∶60），流速：l.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品20.3 mg，置入100 ML容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密吸取該溶液5 mL，移入100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約10 g，精密稱定，精密加入60%乙醇80 mL，稱定重量，加熱回流60 min，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 蘆丁對(duì)照品HPLC圖

圖2 瘤果黑種草子供試品HPLC圖

2.1.4 線性范圍考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液2，4，6，8，10μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程C＝2×106A＋298.4（r＝0.999 9）。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X）作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明蘆丁在0.02～0.1μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度考察

2.1.5.1 日內(nèi)精密度 按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液，在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定蘆丁峰面積，計(jì)算RSD＝0.66%，結(jié)果表明日內(nèi)精密度良好。

2.1.5.2 日間精密度 按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 d，每天測(cè)定1次，每次進(jìn)樣量10μL，測(cè)定蘆丁峰面積，計(jì)算RSD＝1.92%，結(jié)果表明日間精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性考察 取醇提樣品6份，按2.1.3項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液，測(cè)定蘆丁峰面積，計(jì)算RSD＝1.77%，結(jié)果表明方法重復(fù)性符合分析要求。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取醇提樣品1份，按2.1.3項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液，在0，6，12，24，48 h分別精密吸取10μL濾液進(jìn)樣測(cè)定，記錄蘆丁的峰面積，計(jì)算RSD＝1.84%，結(jié)果表明48 h內(nèi)蘆丁樣品較穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量（0.61μg·mL－1）的供試品溶液2 mL，精密加入 10.15μg·mL－1的蘆丁對(duì)照品溶液 0.5，1，1.5 mL混勻，按2.1.3項(xiàng)下制備方法和色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蘆丁加樣回收率試驗(yàn)

2.2 工藝優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)法對(duì)影響提取效果的提取次數(shù)、乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間進(jìn)行考察，在此基礎(chǔ)上固定乙醇濃度，再結(jié)合L9（34）正交試驗(yàn)法對(duì)提取次數(shù)、乙醇用量、提取時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步考察，以浸膏得率和蘆丁的含量為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，篩選最佳提取工藝條件。

2.2.1 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按醇提樣品的制備方法，稱取樣品，按表2進(jìn)行提取，分別測(cè)定蘆丁含量及浸膏得率兩個(gè)考察指標(biāo)，按公式計(jì)算綜合評(píng)分。綜合評(píng)分＝（蘆丁含量/最大蘆丁含量） ×75＋（最小浸膏得率/浸膏得率）×25。結(jié)果見(jiàn)圖3～6。

圖3 提取次數(shù)對(duì)綜合指標(biāo)的影響

圖4 乙醇用量對(duì)綜合指標(biāo)的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)綜合指標(biāo)的影響

圖6 乙醇濃度對(duì)綜合指標(biāo)的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，60%乙醇綜合評(píng)分最高，故選擇60%乙醇提取。提取次數(shù)選擇綜合評(píng)分較高的1、2、3次3個(gè)水平進(jìn)入正交試驗(yàn)，提取時(shí)間選擇綜合評(píng)分較高的1.0，1.5，2.0 h 3個(gè)水平進(jìn)入正交試驗(yàn)，乙醇用量綜合評(píng)分較高的16，18，20倍量3個(gè)水平進(jìn)入正交試驗(yàn)。

2.2.2 正交試驗(yàn) 按L9（34）正交試驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定蘆丁含量及浸膏得率兩個(gè)考察指標(biāo)，按公式計(jì)算綜合評(píng)分。綜合評(píng)分＝（蘆丁含量/最大蘆丁含量） ×75＋（最小浸膏得率/浸膏得率） ×25。結(jié)果見(jiàn)表3～5。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

表4 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表5 方差分析表

以蘆丁含量及綜合評(píng)分為指標(biāo)的正交試驗(yàn)直觀分析、方差分析結(jié)果表明，對(duì)醇提效果影響的大小順序?yàn)镃＞B＞A，其中提取次數(shù)對(duì)提取效果影響最大，提取時(shí)間次之，提取倍量對(duì)提取工藝的影響最小，提取次數(shù)對(duì)醇提效果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。綜合蘆丁含量及綜合評(píng)分方差分析結(jié)果，優(yōu)選醇提工藝條件為A2B3C2，即以18倍量，提取2次，每次2 h為醇提最佳工藝條件。

方差分析結(jié)果顯示，提取倍量與提取時(shí)間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以從大生產(chǎn)上節(jié)約能源、降低成本方面考慮，其最優(yōu)提取工藝為：加入16倍量醇、回流提取2次，每次1 h。

2.2.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取黑種草子10 g，加16倍量60%的乙醇，提取2次，每次1 h，分別測(cè)定2個(gè)考察指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表6，可見(jiàn)按優(yōu)選的最佳工藝提取，有效成分提取率高，提取效果好，且工藝合理穩(wěn)定。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

在黑種草子提取工藝的篩選中，采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法，相對(duì)單指標(biāo)而言可使優(yōu)化工藝的代表性更強(qiáng)。在醇提優(yōu)化工藝的篩選中，以蘆丁及浸膏得率為篩選指標(biāo)，既反映了提取物中有效成分的含量，又反映出保健品預(yù)防疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)—浸膏得率的多少。從正交試驗(yàn)及方差分析表中可以看出，浸膏得率所得到的篩選結(jié)果及影響程度的大小與蘆丁含量及綜合評(píng)分的結(jié)果不一致，因此，說(shuō)明浸膏得率雖然能反映部分提取效果，但并不能完全說(shuō)明提取效率的大小，因此，采用多指標(biāo)評(píng)分法，符合藥物制劑有效性和穩(wěn)定性的要求，客觀、全面地反映提取工藝的優(yōu)劣。

影響中藥材浸出效果的主要因素有溶劑種類、用量、浸出次數(shù)和提取時(shí)間，溶劑的選擇是依據(jù)處方中藥材有效成分的理化性質(zhì)，故預(yù)試驗(yàn)對(duì)藥材作了提取溶劑單因素考察，結(jié)果蘆丁含量水提液低于醇提液，因此確定藥材以乙醇作為提取溶劑。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：241.

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［7］郝海峰，任麗娟，陳玉武.黑種草子化學(xué)成分研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1996，31（9）：689.

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Study on Extraction Process of Xinjiang Characteristic Raw Material for Nigella Glandulifera Freyn.

XIAO Qiong1，JIANG Lin2，LIXiao-jin3，WANG Yue-e1
（1.Xinjiang Medical University，Urumqi 830054；2.The Affiliated Traditional Chinese Medical Hospital；Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；3.XinJiang Institute of Chinese traditionalmedica and ethicalmateria Medica，Urumqi 830002，China）

Objective：To screen the best extraction conditions forNigella glanduliferaFreyn..Methods：The optimum preparation process was investigated by L9（34）orthogonal design with the content of Rutin and extracta sicca yield as index.The chief factors influencing the extraction efficiency include ethanolconsumption，extracted time，extracted times.Results：The optimum extracting conditions was adding 16 times amount of ethanol，extracting 2 times and boiling for 1h each time.Conclusion：The result is credible.The optimal extracting conditions can be used for batch production.

Nigella glanduliferaFreyn.；Rutin；Orthogonal test；Extraction process

國(guó)家科技部支撐項(xiàng)目（2007BAI30B06）

*李曉瑾，Email：xjlxj＠126.com

2010-12-02）